CRISPR-Cas9精細原理：基因敲除、點突變、基因插入PPT課件

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,CRISPR-Cas9,大全：,基因敲除、點突變、基因插入,2015-10-15,CRISPR-Cas系統(tǒng)簡介,CRISPR-Cas系統(tǒng)的應用技術(shù),CRISPR-Cas系統(tǒng)的應用前景,contents,1.,CRISPR-Cas,系統(tǒng)簡介,1.1,CRISPR-Cas,系統(tǒng)的研究歷史,1987,年，日本課題組在,K12,大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復序列，隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細菌和古細菌的基因組中，,2002,年，正式將其命名為,成簇的規(guī)律間隔的短回文,重復序列,2005,年發(fā)現(xiàn),CRISPR,的間隔序列,(spacer),與宿主菌的染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源，推測細菌可能通過,CRISPR,系統(tǒng)可能以類似于真核生物的,RNAi,方式抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵。,2007,年，,Barrangou,等首次發(fā)現(xiàn)細菌可能利用,CRSPR,系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵；,2008,年，,Marraffini,等發(fā)現(xiàn)細菌,CRISPR,系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移，首次利用實驗驗證了,CRISPR,系統(tǒng)的功能,2013,年初，,MIT,的研究組首次利用,CRISPR/Cas9,系統(tǒng)對人,293T,細胞,EMX1,和,PVALB,基因以及小鼠,Nero2A,細胞,Th,基因?qū)崿F(xiàn)了定點突變。同年,Mali,利用,CRISPR/Cas9,在人,293T,細胞和,K652,細胞基因的靶位點形成雙鏈或單鏈的切口，從而激活細胞的,DNA,修復機制高效介導外源基因定點插入。,1.2,CRISPR-Cas,系統(tǒng)的結(jié)構(gòu),CRISPR-CAS 系統(tǒng)的組成主要包括:由不連續(xù)的,重復序列R,(repeat)與長度相似的,間區(qū)序列S,(spacers)間隔排列而成的CRISPR 簇，,前導序列L,(leader)以及一系列,CRISPR 相關(guān)蛋白基因,cas。,Cas蛋白是一種雙鏈,DNA,核酸酶，能在,guide RNA,引導下對靶位點進行切割。它與,folk,酶功能類似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。,1.3 CRISPR-CAS 系統(tǒng)的作用機理,CRISPR 的高度可變的間隔區(qū)的獲得,首先識別入侵的核酸和掃描外源 DNA 潛在的 PAM（NGG序列），將臨近 PAM 的序列作為候選protospacer；然后在 CRISPR 基因座的5端合成重復序列；最后新的間隔序列整合到兩個重復序列之間,1.3 CRISPR-CAS 系統(tǒng)的作用機理,CRIPSR 基因座的表達(包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的成熟加工),當該噬菌體再次入侵細菌時，CRISPR 簇首先轉(zhuǎn)錄為長的crRNA前體，然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。,CRISPR/Cas 系統(tǒng)活性的發(fā)揮或者是對外源遺傳物質(zhì)的干擾,crRNA 結(jié)合相關(guān)的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白復合體，通過堿基互補配對精確地與目標DNA相結(jié)合，隨后Cas 蛋白對目標DNA 進行斷裂和降解。,1.3 CRISPR-CAS 系統(tǒng)的作用機理,2、,CRISPR-Cas,系統(tǒng)的應用,2.1,CRISPR-Cas,9介導的基因組精確編輯技術(shù),基因組編輯技術(shù)是一種可以在基因組水平上對DNA序列進行改造的遺傳操作技術(shù)。,這種技術(shù)的原理是構(gòu)建一個人工內(nèi)切酶，在預定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細胞內(nèi)的DNA修復系統(tǒng)修復過程中會產(chǎn)生突變，從而達到定點改造基因組的目的。,通過修復途徑，基因組編輯技術(shù)可以實現(xiàn)三種基因組改造，即,基因敲除，特異突變的引入和定點轉(zhuǎn)基因,基因組編輯是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人類遺傳性疾病的治療，因此這類技術(shù)成為現(xiàn)代分子生物學的研究熱點,2.1,CRISPR-Cas,9介導的基因組精確編輯技術(shù),CRISPR,s技術(shù)是,一種由,RNA,指導,Cas,蛋白對靶向基因進行修飾的技術(shù)。,Mali 等人 利用來自釀膿鏈球菌和嗜熱鏈球菌中的CRISPR 相關(guān)蛋白Cas9，在一段人為重組的sgRNA(small-guide RNA)的引導下，針對小鼠和人類基因組的特定基因片段實現(xiàn)了精確的剪切。這種通過可編程RNA 進行DNA 改造的技術(shù)為基因組編輯開創(chuàng)了一條新的途徑。,例子：基因敲除的實驗過程,1、在把基因序列中尋找NGG序列獲得其附近20多個堿基的序列，與tracrRNA序列融合，設(shè)計出sgRNA并合成該序列。,2、將該序列以及cas9基因連入如圖所示載體。,3、轉(zhuǎn)化感受態(tài)，質(zhì)粒小提，測序驗證。,4、細胞培養(yǎng)與細胞轉(zhuǎn)染,5、敲除效果檢測。,6、建立穩(wěn)定敲除的細胞株,2.2CRISPR/Cas9介導的轉(zhuǎn)錄抑制與轉(zhuǎn)錄激活,在CRISPR/Cas9的型系統(tǒng)中將Cas9中的切割域突變，會使Cas9蛋白,失去對的切割活性，但不影響其與 結(jié)合的能力,。這種失去切割活性的Cas9蛋白被命名為Dead as9。將Cas9與gRNA在細胞中共表達，則gRNA可以介導Cas9蛋白與 結(jié)合。如果Cas9結(jié)合到靶基因的閱讀框內(nèi)，可阻斷RNA聚合酶的延伸作用；如果Cas9結(jié)合到靶基因的啟動子區(qū)域則可阻止基因轉(zhuǎn)錄的起始,2.2CRISPR/Cas9介導的轉(zhuǎn)錄抑制與轉(zhuǎn)錄激活,CRISPRCas9系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)錄抑制需要PAM（bp）和至少12bp的gRNA配對,利用cr介導dCas9能夠精確識別靶基因的特點，將Cas蛋白與具有轉(zhuǎn)錄激活的蛋白質(zhì)功能域融合則可構(gòu)建具有轉(zhuǎn)錄激活活性的CRISPRon系統(tǒng)。,真核細胞的轉(zhuǎn)錄激活因子可通過將Cas9與單純皰疹病毒轉(zhuǎn)錄激活子16結(jié)合獲得。,3、CRISPR-Cas9技術(shù)的優(yōu)勢與前景,3.1CRISPR-Cas9技術(shù)的優(yōu)勢,而且從實際應用的角度來說，,CRISPRs,比,TALENs,更容易操作，因為每一對,TALENs,都需要重新合成，而用于,CRISPR,的,gRNA,只需要替換,20,個核苷酸就行。,只需合成一個,sgRNA,就能實現(xiàn)對基因的特異性修飾，,Cas,蛋白不具特異性。,編碼,sgRNA,的序列不超過,100bp,，因此比構(gòu),TALENs,和,ZFNs,更簡單方便。,較短的,sgRNA,序列也避免了超長、高度重復,TALENs,編碼載體帶來的并發(fā)癥。,