《CRISPR-Cas9精細(xì)原理：基因敲除、點(diǎn)突變、基因插入PPT課件》由會(huì)員分享，可在線閱讀，更多相關(guān)《CRISPR-Cas9精細(xì)原理：基因敲除、點(diǎn)突變、基因插入PPT課件（13頁(yè)珍藏版）》請(qǐng)?jiān)谘b配圖網(wǎng)上搜索。
1、Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,11/7/2009,#,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),CRISPR-Cas9,大全：,基因敲除、點(diǎn)突變、基因插入,2015-10-15,CRISPR-Cas系統(tǒng)簡(jiǎn)介,CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用技術(shù),CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用前景,contents,1.,CRISPR-Cas,系統(tǒng)簡(jiǎn)介,1.1,CRISPR
2、-Cas,系統(tǒng)的研究歷史,1987,年，日本課題組在,K12,大腸桿菌的堿性磷酸酶基因附近發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復(fù)序列，隨后發(fā)現(xiàn)其廣泛存在于細(xì)菌和古細(xì)菌的基因組中，,2002,年，正式將其命名為,成簇的規(guī)律間隔的短回文,重復(fù)序列,2005,年發(fā)現(xiàn),CRISPR,的間隔序列,(spacer),與宿主菌的染色體外的遺傳物質(zhì)高度同源，推測(cè)細(xì)菌可能通過(guò),CRISPR,系統(tǒng)可能以類(lèi)似于真核生物的,RNAi,方式抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵。,2007,年，,Barrangou,等首次發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可能利用,CRSPR,系統(tǒng)抵抗噬菌體入侵；,2008,年，,Marraffini,等發(fā)現(xiàn)細(xì)菌,CRISPR,系統(tǒng)能阻止外源質(zhì)粒的
3、轉(zhuǎn)移，首次利用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了,CRISPR,系統(tǒng)的功能,2013,年初，,MIT,的研究組首次利用,CRISPR/Cas9,系統(tǒng)對(duì)人,293T,細(xì)胞,EMX1,和,PVALB,基因以及小鼠,Nero2A,細(xì)胞,Th,基因?qū)崿F(xiàn)了定點(diǎn)突變。同年,Mali,利用,CRISPR/Cas9,在人,293T,細(xì)胞和,K652,細(xì)胞基因的靶位點(diǎn)形成雙鏈或單鏈的切口，從而激活細(xì)胞的,DNA,修復(fù)機(jī)制高效介導(dǎo)外源基因定點(diǎn)插入。,1.2,CRISPR-Cas,系統(tǒng)的結(jié)構(gòu),CRISPR-CAS 系統(tǒng)的組成主要包括:由不連續(xù)的,重復(fù)序列R,(repeat)與長(zhǎng)度相似的,間區(qū)序列S,(spacers)間隔排列而成的CRIS
4、PR 簇，,前導(dǎo)序列L,(leader)以及一系列,CRISPR 相關(guān)蛋白基因,cas。,Cas蛋白是一種雙鏈,DNA,核酸酶，能在,guide RNA,引導(dǎo)下對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割。它與,folk,酶功能類(lèi)似，但是它并不需要形成二聚體才能發(fā)揮作用。,1.3 CRISPR-CAS 系統(tǒng)的作用機(jī)理,CRISPR 的高度可變的間隔區(qū)的獲得,首先識(shí)別入侵的核酸和掃描外源 DNA 潛在的 PAM（NGG序列），將臨近 PAM 的序列作為候選protospacer；然后在 CRISPR 基因座的5端合成重復(fù)序列；最后新的間隔序列整合到兩個(gè)重復(fù)序列之間,1.3 CRISPR-CAS 系統(tǒng)的作用機(jī)理,CRIPSR
5、 基因座的表達(dá)(包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后的成熟加工),當(dāng)該噬菌體再次入侵細(xì)菌時(shí)，CRISPR 簇首先轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)的crRNA前體，然后逐步被加工成小的成熟的crRNA。,CRISPR/Cas 系統(tǒng)活性的發(fā)揮或者是對(duì)外源遺傳物質(zhì)的干擾,crRNA 結(jié)合相關(guān)的Cas 蛋白后，形成crRNA-Cas 蛋白復(fù)合體，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)精確地與目標(biāo)DNA相結(jié)合，隨后Cas 蛋白對(duì)目標(biāo)DNA 進(jìn)行斷裂和降解。,1.3 CRISPR-CAS 系統(tǒng)的作用機(jī)理,2、,CRISPR-Cas,系統(tǒng)的應(yīng)用,2.1,CRISPR-Cas,9介導(dǎo)的基因組精確編輯技術(shù),基因組編輯技術(shù)是一種可以在基因組水平上對(duì)DNA序列進(jìn)行改造的遺傳操作技
6、術(shù)。,這種技術(shù)的原理是構(gòu)建一個(gè)人工內(nèi)切酶，在預(yù)定的基因組位置切斷DNA，切斷的DNA在被細(xì)胞內(nèi)的DNA修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生突變，從而達(dá)到定點(diǎn)改造基因組的目的。,通過(guò)修復(fù)途徑，基因組編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)三種基因組改造，即,基因敲除，特異突變的引入和定點(diǎn)轉(zhuǎn)基因,基因組編輯是研究基因功能的重要手段之一，也可被用于人類(lèi)遺傳性疾病的治療，因此這類(lèi)技術(shù)成為現(xiàn)代分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn),2.1,CRISPR-Cas,9介導(dǎo)的基因組精確編輯技術(shù),CRISPR,s技術(shù)是,一種由,RNA,指導(dǎo),Cas,蛋白對(duì)靶向基因進(jìn)行修飾的技術(shù)。,Mali 等人 利用來(lái)自釀膿鏈球菌和嗜熱鏈球菌中的CRISPR 相關(guān)蛋白Cas9，在
7、一段人為重組的sgRNA(small-guide RNA)的引導(dǎo)下，針對(duì)小鼠和人類(lèi)基因組的特定基因片段實(shí)現(xiàn)了精確的剪切。這種通過(guò)可編程RNA 進(jìn)行DNA 改造的技術(shù)為基因組編輯開(kāi)創(chuàng)了一條新的途徑。,例子：基因敲除的實(shí)驗(yàn)過(guò)程,1、在把基因序列中尋找NGG序列獲得其附近20多個(gè)堿基的序列，與tracrRNA序列融合，設(shè)計(jì)出sgRNA并合成該序列。,2、將該序列以及cas9基因連入如圖所示載體。,3、轉(zhuǎn)化感受態(tài)，質(zhì)粒小提，測(cè)序驗(yàn)證。,4、細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞轉(zhuǎn)染,5、敲除效果檢測(cè)。,6、建立穩(wěn)定敲除的細(xì)胞株,2.2CRISPR/Cas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制與轉(zhuǎn)錄激活,在CRISPR/Cas9的型系統(tǒng)中將Cas9
8、中的切割域突變，會(huì)使Cas9蛋白,失去對(duì)的切割活性，但不影響其與 結(jié)合的能力,。這種失去切割活性的Cas9蛋白被命名為Dead as9。將Cas9與gRNA在細(xì)胞中共表達(dá)，則gRNA可以介導(dǎo)Cas9蛋白與 結(jié)合。如果Cas9結(jié)合到靶基因的閱讀框內(nèi)，可阻斷RNA聚合酶的延伸作用；如果Cas9結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域則可阻止基因轉(zhuǎn)錄的起始,2.2CRISPR/Cas9介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制與轉(zhuǎn)錄激活,CRISPRCas9系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)錄抑制需要PAM（bp）和至少12bp的gRNA配對(duì),利用cr介導(dǎo)dCas9能夠精確識(shí)別靶基因的特點(diǎn)，將Cas蛋白與具有轉(zhuǎn)錄激活的蛋白質(zhì)功能域融合則可構(gòu)建具有轉(zhuǎn)錄激活活性的CRI
9、SPRon系統(tǒng)。,真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄激活因子可通過(guò)將Cas9與單純皰疹病毒轉(zhuǎn)錄激活子16結(jié)合獲得。,3、CRISPR-Cas9技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與前景,3.1CRISPR-Cas9技術(shù)的優(yōu)勢(shì),而且從實(shí)際應(yīng)用的角度來(lái)說(shuō)，,CRISPRs,比,TALENs,更容易操作，因?yàn)槊恳粚?duì),TALENs,都需要重新合成，而用于,CRISPR,的,gRNA,只需要替換,20,個(gè)核苷酸就行。,只需合成一個(gè),sgRNA,就能實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的特異性修飾，,Cas,蛋白不具特異性。,編碼,sgRNA,的序列不超過(guò),100bp,，因此比構(gòu),TALENs,和,ZFNs,更簡(jiǎn)單方便。,較短的,sgRNA,序列也避免了超長(zhǎng)、高度重復(fù),TALENs,編碼載體帶來(lái)的并發(fā)癥。,
CRISPR-Cas9精細(xì)原理：基因敲除、點(diǎn)突變、基因插入PPT課件
