熒光標記蛋白的發(fā)展

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7、es,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,Sixth level,Seventh level,Eighth level,Ninth level,*,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,單擊此處編輯母版標題樣式,熒光標記蛋白的發(fā)展,熒光標記蛋白技術(shù)實際上是也是一種標記技術(shù)。就如同最早用P標記脫氧核糖核酸用S標記蛋白質(zhì)是一樣。,左圖所示為驗證DNA和蛋白質(zhì)誰是遺傳物質(zhì)的實驗,熒光標記蛋白在生物研究反面的作用：熒光標記蛋白的基因可作為報告基因，提供細胞內(nèi)物質(zhì)的跟蹤定位,如圖所示為肽鏈的形成過程,肽鏈經(jīng)過彎曲、折

8、疊、多條肽鏈的重疊等形成蛋白質(zhì)。,所以，如若一開始便把熒光標記蛋白的基因插入到某一特定基因內(nèi)，則新的基因會合成熒光融合蛋白,如左圖所示，當體內(nèi)物質(zhì)融合了熒光蛋白后會發(fā)出熒光，用顯微鏡、熒光計、熒光激活細胞分選儀等就可以看見，若在靠近體表處且光源強烈則肉眼可視。,例如，要研究細胞內(nèi)某蛋白質(zhì)的游走狀態(tài)，則用熒光蛋白標記后，其所處位置清晰可見。,最早為水母體中提取的,GFP,在適當刺激下會改變結(jié)構(gòu)從而發(fā)出或改變熒光的第二類熒光蛋白,FHP,及其典例,GPAC,最新的,PRIME,技術(shù),技術(shù)變革,GFP,1，GFP的,發(fā)現(xiàn),GFP是從一種生活在北太平洋寒冷水域的水母體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。這種水母體內(nèi)含有一種生物

9、發(fā)光蛋白質(zhì)aequorin，它本身發(fā)藍光。GFP能把這種光轉(zhuǎn)變成綠色，也就是當水母容光煥發(fā)的時候我們實際看到的顏色。受到Ca2+或紫外線激活時,水母中的發(fā)光蛋白Aequorin 被激活,產(chǎn)生藍光,GFP 能夠吸收藍光(395nm 處有最大光吸收),發(fā)射綠色(或黃綠色)熒光,2，GFP,發(fā)光原理,GFP控制光的部位是其自身的一部分，僅由氨基酸構(gòu)建而成，該部位含有一段三個氨基酸組成的特殊序列：絲氨酸酪氨酸甘氨酸（有時絲氨酸會被相似的蘇氨酸取代）。當?shù)鞍踪|(zhì)鏈折疊時，這段短片段就被深埋在蛋白質(zhì)內(nèi)部，然后，發(fā)生一系列化學反應(yīng)：甘氨酸與絲氨酸之間形成化學鍵，生成一個新的閉合環(huán)，隨后這個環(huán)會自動脫水。最終，

10、經(jīng)過大約一個小時的反應(yīng)，周圍環(huán)境中的的氧氣攻擊酪氨酸的一個化學鍵，形成一個新的雙鍵并合成熒光發(fā)色團。,蛋白質(zhì)鏈形成一個圓柱形罐頭（藍色），子鏈的一部分直接從中間穿過（綠色），發(fā)色團剛好在罐頭盒的中間，它被保護起來以免受周圍環(huán)境的影響。這種保護對于發(fā)射熒光是必需的。,3，與其他報告基因不同的,性質(zhì),從生化角度來講,所有已知的熒光素酶都是氧化酶,它利用分子氧來氧化底物,使產(chǎn)物分子處于一種激發(fā)態(tài)而發(fā)光。這種酶/底物的相互作用是生物發(fā)光的普遍模式。,而GFP 是第一個例外,它的27kDa 的單體由238 個氨基酸構(gòu)成,本身就是一個生物發(fā)光系統(tǒng)。其熒光機制是自身含有的,綠色熒光的發(fā)射僅需分子氧的存在,而

11、,無需其他外源輔因子,GFP 的表達,無種屬特異性,。不管細胞的種類和位置如何,都能夠自主表達;,GFP 還能克服穿透、毒素、光漂白等不利因素1。GFP 的熒光可以耐受福爾馬林的固定,因而可以制成長期保存的標本;,對細胞內(nèi)GFP 的,檢測非常簡單,用顯微鏡、熒光計、熒光激活細胞分選儀等就可實現(xiàn),4，GFP目前存在的,不足,(1)檢測靈敏度還有待提高,而且其熒光信號強度方面的非線性性質(zhì)使得定量非常困難。,(2)新生,GFP 折疊和加工,成為具有熒光活性形式的,過程十分緩慢,使得某些快速過程如轉(zhuǎn)錄的激活過程還難以用該方法進行研究。,(3)紫外激發(fā)對某些GFP 有光漂白和光破壞作用,導(dǎo)致熒光信號快速

12、喪失。,(4)多數(shù)生物具有微弱的自發(fā)熒光現(xiàn)象,并有著類似的激發(fā)和發(fā)射波長,這些熒光背景會影響某些GFP 的檢測。,FHP,（fluorescent highlighter proteins光激活蛋白即第二類熒光蛋白）,及,GPAC,（Green photoactivatable Cherry光激活綠櫻桃）,1，第二類熒光蛋白，,FHP,特點,這些熒光蛋白在適當?shù)拇碳は聲?jīng)歷結(jié)構(gòu)的改變，從而打開熒光這個開關(guān)，或者熒光發(fā)射波長改變。,與第一代熒光蛋白相比，它們的優(yōu)勢在于能脈沖標記細胞或分子亞群，從而實現(xiàn)復(fù)雜的,動力學時空分析,典例：PAGFP，mRFP1，KFP1，Dronpa等,缺點,：其中一些

13、蛋白光轉(zhuǎn)換效率不高，亮度較低，會迅速淬滅，或者需要多聚化。此外，光轉(zhuǎn)換通常伴隨著第一種顏色的喪失，這樣不得不借助計算機方法來查看整個群體。,2,GPAC,構(gòu)成：,這是一個融合蛋白，它融合了,紅色熒光蛋白（RFP）單體Cherry,和,GFP的光激活變異體,。這種融合蛋白能夠在表達標志物的細胞中持續(xù)發(fā)出紅色熒光，而綠色熒光只有在405-nm光激發(fā)下才會發(fā)出。,特點,：,表達GPAC的細胞在光激活前后都表現(xiàn)出強的紅色信號，而綠色熒光只持續(xù)數(shù)小時。,將某一特定蛋白放置在GPAC的N端或C端，均不影響其活性，也不會顯著影響胞內(nèi)蛋白的定位或功能。即便融合伴侶需要大量的翻譯后加工和修飾，GPAC仍可容忍。

14、,不足,：熒光標簽相對較大，超過了50 kDa，這樣，與GPAC融合的蛋白在用于功能研究前就必須進行仔細的驗證,其,杰出性,體現(xiàn)在：在時空動力學監(jiān)測中突出了光轉(zhuǎn)換的部分。,PRIME技術(shù),開發(fā)此技術(shù)的,原因,：無論是GPAC還是GFP，他們都有一個缺點，蛋白過大。一旦熒光探針過大，它們就有可能干擾蛋白的正常功能，或妨礙它們到達目的地。,如：238個氨基酸的GFP干擾了一些蛋白的功能，比如肌動蛋白actin。此蛋白參與了細胞分裂、運動及通訊。然而研究人員發(fā)現(xiàn)，與GFP的融合對肌動蛋白的功能和運輸有著不利影響。,概述,：PRIME技術(shù)使用一種比GFP小得多的藍色熒光探針。與GFP不同的是，新探針一

15、開始并不與目的蛋白相連。它是在后來通過一種全新的酶而附在蛋白上。這種全新的酶被稱為熒光基團連接酶。,原理,：,原理,：在導(dǎo)入目的基因的同時也將編碼這種酶的基因?qū)爰毎?。還在目的基因上加上了一個短的標簽（13個氨基酸），此標簽讓連接酶識別蛋白,隨后，目的蛋白質(zhì)與熒光基團蛋白質(zhì)同時產(chǎn)生,當7-香豆素這種藍色熒光探針進入細胞后，連接酶將它與目的蛋白上的短標簽相連。這便使融合熒光蛋白發(fā)出可見熒光,優(yōu)點,：,使用這種方法后，標有熒光探針的肌動蛋白能在細胞中自由游走，并穿過細胞核。,此方法能應(yīng)用于細胞內(nèi)特定區(qū)域的蛋白，比如細胞核、細胞膜或細胞溶質(zhì)。在連接酶上加入一段信號肽，指導(dǎo)它到達特定區(qū)域。之后，酶將熒光探針與此區(qū)域的蛋白相連。,