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1、單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,目錄,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,目錄,第一章,蛋白質的結構與功能,Structure and Function of Protein,蛋白質,(protein),是由許多,氨基酸,(amino acids),通過,肽鍵,(peptide bond),相連形成的高分子含,氮,化合物。,蛋白質研究的歷史,1833,年，從麥芽中分離淀粉酶；隨后從胃液中分離到類似胃蛋
2、白酶的物質。,1864,年，血紅蛋白被分離并結晶。,19,世紀末，證明蛋白質由氨基酸組成，并合成了多種短肽。,20,世紀初，發(fā)現(xiàn)蛋白質的二級結構；完成胰島素一級結構測定。,20,世紀中葉，各種蛋白質分析技術相繼建立，促進了蛋白質研究迅速發(fā)展；,1962,年，確定了血紅蛋白的四級結構。,20,世紀,90,年代，功能基因組與蛋白質組研究展開。,蛋白質的生物學重要性,分布廣：,所有器官、組織都含有蛋白質；細胞的各個部分都含有蛋白質。,含量高：,蛋白質是細胞內最豐富的有機分子，占人體干重的,45,，某些組織含量更高，例如脾、肺及橫紋肌等高達,80,。,1.,蛋白質是生物體重要組成成分,1,）酶的生物催
3、化作用,2.,蛋白質具有重要的生物學功能,2,）調控作用,參與基因調控：組蛋白、非組蛋白等,參與代謝調控：如激素或生長因子等,3,）運動與支持,機體的結構蛋白：,頭發(fā)、骨骼、牙齒、肌肉等,4,）參與運輸貯存的作用,血紅蛋白,運輸氧,銅藍蛋白,運輸銅,鐵蛋白,貯存鐵,5,）免疫保護作用,抗原抗體反應,凝血機制,6,）參與細胞間信息傳遞,信號傳導中的受體、信息分子等,作為生物催化劑（酶）,代謝調節(jié)作用,免疫保護作用,物質的轉運和存儲,運動與支持作用,參與細胞間信息傳遞,2.,蛋白質具有重要的生物學功能,3.,氧化供能,蛋白質的分子組成,The Molecular Component of Prot
4、ein,第 一 節(jié),蛋白質的元素組成,主要有,C,、,H,、,O,、,N,和,S,。,有些蛋白質含有少量,P,或金屬元素,Fe,、,Cu,、,Zn,、,Mn,、,Co,、,Mo,，個別蛋白質還含有,I,。,各種蛋白質的含氮量很接近，平均為,16,。,由于體內的含氮物質以蛋白質為主，因此，只要測定生物樣品中的含氮量，就可以根據以下公式推算出蛋白質的大致含量：,100,克樣品中蛋白質的含量,(g,%,),=,每克樣品含氮克數(shù), 6.25100,1/16%,蛋白質元素組成的特點,一、氨基酸,蛋白質的基本組成單位,存在自然界中的氨基酸有,300,余種，但組成人體蛋白質的氨基酸僅有,20,種，且均屬,L
5、-,-,氨基酸,（甘氨酸除外）。,鏡子,COOH,NH,2,C,NH,2,COOH,C,R,L-,構型,D-,構型,H,R,H,H,甘氨酸,CH,3,丙氨酸,L-,氨基酸的通式,R,非極性脂肪族氨基酸,極性中性氨基酸,芳香族氨基酸,酸性氨基酸,堿性氨基酸,二、氨基酸,可根據側鏈結構和理化性質進行分類,* 20,種氨基酸的英文名稱、縮寫符號及分類如下,:,(,一,),側鏈含烴鏈的氨基酸屬于非極性脂肪族氨基酸,(,二,),側鏈有極性但不帶電荷的氨基酸是極性中性氨基酸,(,三,),側鏈含芳香基團的氨基酸是芳香族氨基酸,(,四,),側鏈含負性解離基團的氨基酸是酸性氨基酸,(,五,),側鏈含正性解離基團
6、的氨基酸屬于堿性氨基酸,Lys, K,Arg, R,His, H,guanidyl,imidazol,Asp, D,Glu, E,carboxyl,carboxyl,methylthio,mercapto,Cys,C,Met,M,hydroxy,Ser,S,Thr,T,Tyr,Y,hydroxy,Phenyl,Phe,F,Tyr,Y,Trp,W,Val,V,Leu,L,Ile,I,Gly,G,Ala,A,Pro,P,carbonyl,carbonyl,Asn,N,Gln,Q,習慣分類方法,芳香族氨基酸,：,Trp,、,Tyr,、,Phe,含羥基氨基酸,：,Ser,、,Thr,、,Tyr,含硫氨
7、基酸,：,Cys,、,Met,雜環(huán)族氨基酸：,His,雜環(huán)族亞氨基酸：,Pro,支鏈氨基酸,：,Val,、,Leu,、,Ile,氨基酸分類歸納：,堿性賴精組，酸性天和谷,芳香苯色酪，分支纈亮異,含硫半甲硫，羥基酪蘇絲,You should know names, structures,3-letter codes,幾種特殊氨基酸,脯氨酸,（亞氨基酸）,甘氨酸,（無手性碳原子）,半胱氨酸,+,胱氨酸,二硫鍵,-,H,H,修飾氨基酸：,蛋白質合成后通過修飾加工生成的氨基酸。沒有相應的編碼。如：胱氨酸、羥脯氨酸（,Hyp,）、羥賴氨酸（,Hyl,）。,非生蛋白氨基酸：,蛋白質中不存在的氨基酸。如：瓜
8、氨酸、鳥氨酸、同型半胱氨酸，是代謝途徑中產生的。,Modified amino acids,修飾氨基酸，無密碼子編碼,Selenium, Se,Sulfur, S,羥脯氨酸,羥賴氨酸,amino acids not-presented in proteins,鳥氨酸,瓜氨酸,不出現(xiàn)在蛋白質結構中的氨基酸,三、,20,種氨基酸具有共同或特異的理化性質,兩性解離及等電點,氨基酸是兩性電解質，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。,等電點,(isoelectric point, pI),在某一,pH,的溶液中，氨基酸解離成陽離子和陰離子的趨勢及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時溶液的,pH,值,稱為
9、該氨基酸的,等電點,。,（一）氨基酸具有兩性解離的性質,pH=,pI,+OH,-,pH,pI,+H,+,+OH,-,+H,+,pH,pI,氨基酸的兼性離子,陽離子,陰離子,The pI is the pH midway between pK value on either side of the isoelectric species.,For Example,Glycine,Glutamate,Histidine,pI,的計算,:,pI = (pK,1,+pK,2,)/2,An acidic amino acid pI=(pK,1,+pK,R,)/2,A basic amino acid p
10、I=(pK,R,+pK,2,)/2,（二）含共軛雙鍵的氨基酸具有紫外吸收性質,色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在,280 nm,附近。,大多數(shù)蛋白質含有這兩種氨基酸殘基，所以測定蛋白質溶液,280nm,的光吸收值是分析溶液中蛋白質含量的快速簡便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,（三）氨基酸與茚三酮反應生成藍紫色化合物,氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成,藍紫色,化合物，其最大吸收峰在,570nm,處。,由于此吸收峰值與氨基酸的含量存在正比關系，因此可作為氨基酸定量分析方法。,茚三酮反應,四、蛋白質是由許多氨基酸殘基組成的多肽鏈,肽鍵,(,peptide bond,),是由一個氨基酸的,-,羧基與另一個
11、氨基酸的,-,氨基脫水縮合而形成的化學鍵。,（一）,氨基酸通過肽鍵連接而形成肽,(peptide),+,-,H,OH,甘氨酰甘氨酸,肽鍵,肽是由氨基酸通過肽鍵縮合而形成的化合物。,兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽,肽鏈中的氨基酸分子因為脫水縮合而基團不全，被稱為氨基酸殘基,(residue),。,由十個以內氨基酸相連而成的肽稱為寡肽,(oligopeptide),，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽,(polypeptide),。,N,末端：多肽鏈中有,游離,-,氨基,的一端,C,末端：多肽鏈中有,游離,-,羧基,的一端,多肽鏈有兩端：,多肽鏈,(polypeptide ch
12、ain),是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結構。,多肽鏈,多肽鏈,N,末端,C,末端,牛核糖核酸酶,（二）,幾種生物活性肽,1.,谷胱甘肽,(glutathione, GSH),結構,:,谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的,三肽,谷氨酸的,-,羧基,形成肽鍵,SH,為活性基團,為,酸性肽,是體內重要的,還原劑,GSH,過氧化物酶,H,2,O,2,2GSH,2H,2,O,GSSG,GSH,還原酶,NADPH,+,H,+,NADP,+,主要功能,:,GSH,有抗氧化劑的作用，可還原細胞內產生的過氧化氫,谷胱甘肽的生理功用：,解毒作用：,參與氧化還原反應：,保護巰基酶的活性：,抗氧化劑作用，維持紅
13、細胞膜的穩(wěn)定：,肽類激素：如促甲狀腺素釋放激素（,TRH,）,神經肽,(neuropeptide),2.,肽類激素及神經肽,蛋 白 質 的 分 子 結 構,The Molecular Structure of Protein,第 二 節(jié),蛋白質的分子結構包括：,一級結構,(primary structure),二級結構,(secondary structure),三級結構,(tertiary structure),四級結構,(quaternary structure),高級結構,定義：,蛋白質的一級結構指多肽鏈中氨基酸的排列順序。,一、蛋白質的一級結構,主要化學鍵：,肽鍵,二硫鍵,的位置屬于一
14、級結構研究范疇。,胰島素的一級結構,30,21,一級結構是蛋白質空間構象和特異生物學,功能的基礎,，,但不是決定蛋白質空間構象的,唯一因素,。,二、,多肽鏈的局部主鏈構象為蛋白質,二級結構,蛋白質分子中某一段肽鏈的局部空間結構，即該段肽鏈主鏈骨架原子的相對空間位置，并不涉及氨基酸殘基側鏈的構象,。,定義,:,主要的化學鍵,：,氫鍵,（一）參與肽鍵形成的,6,個原子在同一平面上,參與肽鍵的,6,個原子,C,1,、,C,、,O,、,N,、,H,、,C,2,位于同一平面，,C,1,和,C,2,在平面上所處的位置為反式,(trans),構型，此同一平面上的,6,個原子構成了所謂的,肽單元,(,pept
15、ide unit),。,由于,C=O,雙鍵中的,電子云,與,N,原子上的未共用電子對,發(fā)生,“,電子共振,”,，使肽鍵具有,部分雙鍵,的性質，,不能自由旋轉,。,蛋白質立體結構原則,肽單元,H,H,H,H,（一）參與肽鍵形成的,6,個原子在同一平面上,參與肽鍵的,6,個原子,C,1,、,C,、,O,、,N,、,H,、,C,2,位于同一平面，,C,1,和,C,2,在平面上所處的位置為反式,(trans),構型，此同一平面上的,6,個原子構成了所謂的,肽單元,(,peptide unit),。,-,螺旋,(,-helix),-,折疊,(,-pleated sheet,),-,轉角,(,-turn)
16、,無規(guī)卷曲,(random coil),（二）,-,螺旋結構是常見的蛋白質二級結構,蛋白質二級結構,-,螺旋,0.54nm,-helix,R-residue stretch out ,steric interactions,Top view,-,螺旋,結構要點,:,多肽鏈主鏈圍繞中心軸形成,右手螺旋,，,側鏈,伸向螺旋外側。,每圈螺旋含,3.6,個氨基酸,，螺距為,0.54nm,。,每個肽鍵的亞氨氫和第四個肽鍵的羰基氧形成的氫鍵保持螺旋穩(wěn)定。,氫鍵,與螺旋長軸基本平行。,（三）,-,折疊使多肽鏈形成片層結構,-pleated sheet,-pleated sheet,（三）,-,折疊,多肽鏈充
17、分伸展，相鄰肽單元之間折疊成鋸齒狀結構，側鏈位于鋸齒結構的上下方。,兩段以上的,-,折疊結構平行排列 ，兩鏈間可順向平行，也可反向平行 。,兩鏈間的肽鍵之間形成氫鍵，以穩(wěn)固,-,折疊結構。氫鍵與螺旋長軸垂直。,Pro,存在處往往形成,-,轉角。,（四）,-,轉角和無規(guī)卷曲,-,轉角：,-,轉角：,肽鏈內形成,180,回折。,含,4,個氨基酸殘基，第一個氨基酸殘基與第四個形成氫鍵。, 第二個氨基酸殘基常為,Pro,。,無規(guī)卷曲：沒有確定規(guī)律性的肽鏈結構。,（五）模體,是具有特殊功能的超二級結構,在許多蛋白質分子中，可發(fā)現(xiàn)二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個,有規(guī)則的二級結構組
18、合，被稱為,超二級結構,。,二級結構組合形式有,3,種：,，,，,二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個特殊的空間構象，稱為,模體,(motif),。,模體是具有特殊功能的超二級結構。,鈣結合蛋白中結合鈣離子的模體,鋅指結構,-,螺旋,-,轉角（或環(huán)）,-,螺旋模體,鏈,-,轉角,-,鏈模體,鏈,-,轉角,-,螺旋,-,轉角,-,鏈模體,模體常見的形式,螺旋折疊折疊,2,個,His,和,2,個,Cys,與,Zn,離子結合,螺旋區(qū) 與,DNA,結合,（六）氨基酸殘基的側鏈對二級結構形成的影響,蛋白質二級結構是以一級結構為基礎的。一段肽鏈其氨基酸殘基的側鏈適合形成,-,螺旋或,-
19、,折疊，它就會出現(xiàn)相應的二級結構。,影響二級結構形成的因素,氨基酸側鏈所帶電荷 、大小及形狀。,影響,-,螺旋形成的因素：,-,折疊形成條件：,要求氨基酸側鏈較小。,妨礙,-,螺旋形成的主要因素：,（,1,）多個酸性,AA,相鄰或多個堿性,AA,相鄰，,R,帶同種電荷相斥。,（,2,）,Asn , Leu,存在處，,R,側鏈大。,（,3,）,Pro,存在，,Pro,的,N,原子位于剛性五元環(huán)中，妨礙盤曲而使肽鏈走向轉折，不能形成,-,螺旋,-,折疊形成的條件：,較小的,R,（如,Gly , Ala,）容許兩條肽段彼此接近。,蠶絲蛋白中含大量,Gly,Ala,，故富含,-,折疊。,Pro,存在處
20、往往形成,-,轉角。,三、,在二級結構基礎上多肽鏈進一步折疊形成蛋白質三級結構,疏水鍵、離子鍵、氫鍵和,Van der Waals,力等。,主要的化學鍵,:,整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。,定義,:,（一）三級結構是指整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對空間位置,Noncovalent bond,肌紅蛋白,(Mb),N,端,C,端,纖連蛋白分子的結構域,（二）結構域,是三級結構層次上的局部折疊區(qū),分子量較大的蛋白質常可折疊成多個結構較為緊密的區(qū)域，并各行其功能，稱為結構域,(,domain,),。,（三）分子伴侶,參與蛋白質折疊,分子伴侶,(chape
21、ron),通過提供一個保護環(huán)境從而加速蛋白質折疊成天然構象或形成四級結構。,分子伴侶可逆地,與未折疊肽段的疏水部分,結合隨后松開，如此重復進行可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確折疊。,分子伴侶也可,與錯誤聚集的肽段結合,，使之解聚后，再誘導其正確折疊。,分子伴侶在蛋白質分子,折疊過程中,二硫鍵的正確形成起了重要的作用。,伴侶蛋白在蛋白質折疊中的作用,亞基之間的結合主要是,氫鍵,和,離子鍵,。,四、,含有二條以上多肽鏈的蛋白質具有四級結構,蛋白質分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為,蛋白質的四級結構,。,有些蛋白質分子含有二條或多條多肽鏈，每一條多肽鏈都有完整的三級結構，稱為
22、蛋白質的,亞基,(subunit),。,胰島素受體：,由,4,個亞基組成,(,2,2,),，,亞基與,亞基形成單體,(monomer),，,2,個單體形成二聚體,(dimer),。,由,2,個亞基組成的蛋白質四級結構中，若亞基分子結構相同，稱之為,同二聚體,(homodimer),，若亞基分子結構不同，則稱之為,異二聚體,(heterodimer),。,血紅蛋白的四級結構,4 subunits,血紅蛋白,的四級結構,血紅蛋白的四個亞基緊密結合，亞基之間的維系鍵是,亞基之間的,8,個鹽鍵,五、蛋白質的分類,*,根據蛋白質組成成分,單純蛋白質：,如，血清清蛋白,結合蛋白質,=,蛋白質部分,+,非蛋
23、白質部分,如：糖蛋白、脂蛋白、磷蛋白、金屬蛋白等,*,根據蛋白質形狀,纖維狀蛋白質：,多為,結構蛋白,，難溶于水,球狀蛋白質：,多數(shù)具有,生理活性，,多數(shù)可溶,如酶、免疫球蛋白等等,分類,輔基,舉例,脂蛋白,脂類,血漿脂蛋白（,VLDL,、,LDL,、,HDL,等）,糖蛋白,糖基或糖鏈,膠原蛋白、纖連蛋白等,核蛋白,核酸,核糖體,磷蛋白,磷酸基團,酪蛋白（,casein,）,血紅素蛋白,血紅素（鐵卟啉）,血紅蛋白、細胞色素,c,黃素蛋白,黃素核苷酸（,FAD,、,FMN,）,琥珀酸脫氫酶,金屬蛋白,鐵,鐵蛋白,鋅,乙醇脫氫酶,鈣,鈣調蛋白,錳,丙酮酸羧化酶,銅,細胞色素氧化酶,結合蛋白質及其輔
24、基,六、蛋白質組學,（一）蛋白質組學基本概念,蛋白質組是指一種細胞或一種生物所表達的全部蛋白質，即,“,一種基因組所表達的全套蛋白質,”,。,（二）蛋白質組學研究技術平臺,蛋白質組學是高通量，高效率的研究,:,雙向電泳分離樣品蛋白質,蛋白質點的定位、切取,蛋白質點的質譜分析,（三）蛋白質組學研究的科學意義,蛋白質結構與功能的關系,The Relation of Structure and Function of Protein,第 三 節(jié),（一）一級結構是空間構象的基礎,一、蛋白質一級結構與功能的關系,牛核糖核酸酶的一級結構,二硫鍵,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、,-,巰基乙醇,去除尿素、,-,
25、巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,（二）一級結構相似的蛋白質具有相似的高級結構與功能,胰島素,氨基酸殘基序號,A5,A6,A10,B3,0,人,Thr,Ser,Ile,Thr,豬,Thr,Ser,Ile,Ala,狗,Thr,Ser,Ile,Ala,兔,Thr,Gly,Ile,Ser,牛,Ala,Gly,Val,Ala,羊,Ala,Ser,Val,Ala,馬,Thr,Ser,Ile,Ala,Primary Structure Determines Function,Similar primary structure, similar spatial conformation, similar fun
26、ction,（三）,氨基酸序列提供重要的生物化學信息,一些廣泛存在于生物界的蛋白質如細胞色素,(cytochrome C),，比較它們的一級結構，可以幫助了解物種進化間的關系。,（四）重要蛋白質的氨基酸序列改變可引起疾病,例：鐮刀形紅細胞貧血,N-val his leu thr pro ,glu, glu C(146),HbS,肽鏈,HbA,肽 鏈,N-val his leu thr pro ,val, glu C(146),這種由蛋白質分子發(fā)生變異所導致的疾病，稱為“分子病”。,肌紅蛋白,/,血紅蛋白含有血紅素輔基,血紅素結構,二、,蛋白質的功能依賴特定空間結構,（一）,血紅蛋白亞基與肌紅蛋
27、白結構相似,Heme,Fe,2+,His(F8),structure of Mb and Hb,Conjugated protein: aa+ Heme,Comparation of Mb and Hb,Primary structure (consensus sequence),Spacial structure,Myoglobulin:,Globular protein, 153aa, 8 helix A-H,heme,crystal,Molecular structure of hemoglobin,covalent noncovalent,bond bond,Hb,2,2,2,141a
28、a,2,146aa,4 heme 4O,2,8 pairs of salt bond,Tense state,Relaxed state,肌紅蛋白,(,myoglobin,，,Mb,),肌紅蛋白是一個只有三級結構的單鏈蛋白質，有,8,段,-,螺旋結構。,血紅素分子中的兩個丙酸側鏈以離子鍵形式與肽鏈中的兩個堿性氨基酸側鏈上的正電荷相連，加之肽鏈中的,F8,組氨酸殘基還與,Fe,2+,形成配位結合，所以血紅素輔基與蛋白質部分穩(wěn)定結合。,血紅蛋白,(,hemoglobin,，,Hb,),血紅蛋白具有,4,個亞基組成的四級結構，,每個亞基可結合,1,個血紅素并攜帶,1,分子氧,。,Hb,亞基之間通過,
29、8,對鹽鍵，使,4,個亞基緊密結合而形成親水的球狀蛋白。,肌紅蛋白,Mb,血紅蛋白,Hb,Hb,與,Mb,一樣能可逆地與,O,2,結合，,Hb,與,O,2,結合后稱為,氧合,Hb,。氧合,Hb,占總,Hb,的百分數(shù)（稱,百分飽和度,）隨,O,2,濃度變化而改變。,（二）血紅蛋白亞基構象變化可影響亞基與氧結合,肌紅蛋白,(Mb),和血紅蛋白,(Hb),的氧解離曲線,協(xié)同效應,(,cooperativity,),一個寡聚體蛋白質的一個亞基與其配體結合后，能影響此寡聚體中另一個亞基與配體結合能力的現(xiàn)象，稱為,協(xié)同效應,。,如果是促進作用則稱為,正協(xié)同效應,(,positive cooperativi
30、ty,),如果是抑制作用則稱為,負協(xié)同效應,(,negative cooperativity,),Two status of Hb,low O,2,affinity,T-state,and high affinity,R-state,.,Hb,未與,O,2,結合的時候，,Fe,2+,位于卟啉環(huán)平面外側，與,F8His,連接，當?shù)谝粋€,O,2,與,Fe,2+,結合后，被拉到平面中，使得牽動,F8,螺旋片段，導致亞基之間鹽鍵斷裂、結合變松弛，使易于與第二個亞基結合,變構效應,(allosteric effect),蛋白質空間結構的改變伴隨其功能的變化，稱為,變構效應,。,變構效應與協(xié)同效應,協(xié)同效
31、應：,一個亞基與其配體（,O,2,）結合后，可影響寡聚體中另一亞基與配體的結合能力的現(xiàn)象稱為,協(xié)同效應,起促進作用的，為,正協(xié)同效應,起抑制作用的，為,負協(xié)同效應,變構效應：,由于小分子（,O,2,）與大分子（,Hb,）亞基結合，導致蛋白質分子構象改變及功能變化的現(xiàn)象稱為,變構效應,。,小分子物質，稱為,變構效應劑,（三）蛋白質構象改變,可引起疾病,蛋白質構象疾病,：若蛋白質的折疊發(fā)生錯誤，盡管其一級結構不變，但蛋白質的構象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴重時可導致疾病發(fā)生。,蛋白質構象改變導致疾病的機理,：有些蛋白質錯誤折疊后相互聚集，常形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產生毒性而致病，表現(xiàn)為蛋
32、白質淀粉樣纖維沉淀的病理改變。,這類疾病包括,：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。,瘋牛病是由朊病毒蛋白,(prion protein, PrP),引起的一組人和動物神經退行性病變。,正常的,PrP,富含,-,螺旋，稱為,PrP,c,。,PrP,c,在某種未知蛋白質的作用下可轉變成全為,-,折疊的,PrP,sc,，從而致病。,PrP,c,-,螺旋,PrP,sc,-,折疊,正常,瘋牛病,瘋牛病中的蛋白質構象改變,1986, England mad cow disease (,牛腦海綿樣病,),prion relative protein, PrP,（朊病毒蛋白）,m.w.
33、33,35 kD.,Normal,PrPc,，,40%,-helix, little,-folding sensitive to proteinase,Abnormal,PrPSc 30%,-helix 45%,-folding (,- pleated-sheet ),PrP,sc,(,-pleated sheet),Normal,PrP,c,(,-helix),mad cow disease,正常朊病毒蛋白與朊病毒空間結構的差異,朊病毒（,PrP,sc,）是蛋白質，不含核酸。它是正常朊病毒蛋白（,PrP,c,）的空間,構象由,-,螺旋變成,-,片層結構所致。因此，這類疾病又稱蛋白質構象病。朊
34、病毒,本身不能復制，但它卻可以攻擊大腦的正常朊病毒蛋白，使其發(fā)生構象改變，,并與其結合，成為致病的朊病毒二聚體。此二聚體再攻擊正常的朊病毒蛋白。這,樣，腦組織中的朊病毒不斷積蓄，造成腦組織發(fā)生退行性變。,正常朊病毒蛋白結構,（顯示,-,螺旋,）,朊病毒結構,（顯示,-,片層結構,）,第四節(jié),蛋白質的理化性質,The Physical and Chemical Characters of Protein,一、,蛋白質具有兩性電離的性質,蛋白質分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側鏈中某些基團，在一定的溶液,pH,條件下都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。,當?shù)鞍踪|溶液處于某一,pH,時，蛋白
35、質解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的,pH,稱為,蛋白質的等電點。,蛋白質的等電點,( isoelectric point, pI),利用蛋白質兩性電離的性質，可通過電泳、離子交換層析、等電聚焦等技術分離蛋白質。,二、蛋白質具有膠體性質,蛋白質屬于生物大分子之一，分子量可自,1,萬至,100,萬之巨，其分子的直徑可達,1,100nm,，為膠粒范圍之內。,顆粒表面電荷,水化膜,蛋白質膠體穩(wěn)定的因素,:,+,+,+,+,+,+,+,帶正電荷的蛋白質,帶負電荷的蛋白質,在等電點的蛋白質,水化膜,+,+,+,+,+,+,+,+,帶正電荷的蛋白質,帶負電荷的蛋白質,不穩(wěn)定
36、的蛋白質顆粒,酸,堿,酸,堿,酸,堿,脫水作用,脫水作用,脫水作用,溶液中蛋白質的聚沉,三、蛋白質空間結構破壞而引起變性,在某些物理和化學因素作用下，其特定的空間構象被破壞，也即有序的空間結構變成無序的空間結構，從而導致其理化性質改變和生物活性的喪失。,蛋白質的變性,(denaturation),我國生物化學的開拓者,吳憲,教授,蛋白質研究領域內國際上最具有權威性的綜述性叢書,Advances in Protein Chemistry,第,47,卷（,1995,年）發(fā)表了美國哈佛大學教授、蛋白質研究的老前輩,J. T. Eddsall,的文章“吳憲與第一個蛋白質變性理論（,1931,）,Hsi
37、en Wu and the first Theory of Protein Denaturation(1931)”,，對吳憲教授的學術成就給予了極高的評價。該卷還重新刊登了吳憲教授六十四年前關于蛋白質變性的論文。一篇在,1931,年發(fā)表的論文居然在,1995,年仍然值得在第一流的叢書上重新全文刊登，不能不說是國際科學界的一件極為罕見的大事。,造成變性的因素,:,如,加熱、乙醇等有機溶劑、強酸、強堿、重金屬離子及生物堿試劑等,。,變性的本質,:,破壞非共價鍵和二硫鍵，不改變蛋白質的一級結構。,應用舉例,臨床醫(yī)學上，變性因素常被應用來消毒及滅菌。,防止蛋白質變性也是有效保存蛋白質制劑（如疫苗等）的
38、必要條件。,蛋白質變性后的性質改變：,溶解度降低、粘度增加、結晶能力消失、生物活性喪失及易受蛋白酶水解。,若蛋白質變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質仍可恢復或部分恢復其原有的構象和功能，稱為,復性,(renaturation),。,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、,-,巰基乙醇,去除尿素、,-,巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無活性,在一定條件下，蛋白疏水側鏈暴露在外，肽鏈融會相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。,變性的蛋白質易于沉淀，有時蛋白質發(fā)生沉淀，但并不變性。,蛋白質變性后的絮狀物加熱可變成比較堅固的凝塊，此凝塊不易再溶于強酸和強堿中。,蛋白質沉淀,蛋白質的凝固作用,(protein coagul
39、ation),蛋白質的變性、沉淀和凝固,沉淀的蛋白質不一定變性，也不一定凝固；,變性的蛋白質易于沉淀，但也不一定沉淀；,凝固的蛋白質一般沉淀，同時變性。,四、蛋白質,在紫外光譜區(qū)有特征性吸收峰,由于蛋白質分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在,280nm,波長處有特征性吸收峰。蛋白質的,OD,280,與其濃度呈正比關系，因此可作蛋白質定量測定。,蛋白質經水解后產生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應。,蛋白質和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應稱為,雙縮脲反應,，雙縮脲反應可用來檢測蛋白質水解程度。,五、應用蛋白質呈色反應可測定蛋白質溶液含量,茚三酮反應,(ninhydr
40、in reaction),雙縮脲反應,(biuret reaction),第五節(jié),蛋白質的分離純化與結構分析,The Separation and Purification and Structure Analysis of Protein,一、,透析及超濾法可去除蛋白質溶液中的小分子化合物,應用正壓或離心力使蛋白質溶液透過有一定截留分子量的超濾膜，達到濃縮蛋白質溶液的目的。,透析,(dialysis),超濾法,利用透析袋把大分子蛋白質與小分子化合物分開的方法,。,Dialysis: size, semipermeable membrane,二、丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀是常用的蛋白質沉淀方法,
41、使用,丙酮沉淀,時，必須在,0,4,低溫下進行，丙酮用量一般,10,倍于蛋白質溶液體積。蛋白質被丙酮沉淀后，應立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。,鹽析,(salt precipitation),是將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質溶液，使蛋白質表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導致蛋白質沉淀。,免疫沉淀法：,將某一純化蛋白質免疫動物可獲得抗該蛋白的特異抗體。利用特異抗體識別相應的抗原蛋白，并形成抗原抗體復合物的性質，可從蛋白質混合溶液中分離獲得抗原蛋白。,三、利用荷電性質可用電泳法將蛋白質分離,蛋白質在高于或低于其,pI,的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質在
42、電場中泳動而達到分離各種蛋白質的技術,稱為,電泳,(elctrophoresis),。,根據支撐物的不同，可分為薄膜電泳、凝膠電泳等。,*,醋酸纖維薄膜電泳，,以,醋酸纖維薄膜作為支撐物。,*聚丙烯酰胺凝膠電泳,，以,聚丙烯酰胺凝膠作為支撐物。,*,SDS-PAGE,常用于蛋白質分子量的測定。,*等電聚焦電泳,，以兩性電解質作為支持物。,*免疫電泳,，以瓊脂或瓊脂糖凝膠為支持物。,*二維電泳，,等電聚焦,+SDS-PAGE,幾種常用的蛋白質電泳,SDS-,聚丙烯酰胺凝膠電泳,(SDSPAGE),二維電泳,2D gel in proteomics,SDS-,聚丙烯酰胺凝膠電泳,，常用于蛋白質分子
43、量的測定。,等電聚焦電泳,，通過蛋白質等電點的差異而分離蛋白質的電泳方法。,雙向凝膠電泳,是蛋白質組學研究的重要技術。,幾種重要的蛋白質電泳,:,四、,應用相分配或親和原理可將蛋白質進行層析分離,待分離蛋白質溶液（流動相）經過一個固態(tài)物質（固定相）時，根據溶液中待分離的蛋白質顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質組分在兩相中反復分配，并以不同速度流經固定相而達到分離蛋白質的目的。,層析,(chromatography),分離蛋白質的原理,離子交換層析：,利用各蛋白質的電荷量及性質不同進行分離。,凝膠過濾,(gel filtration),又稱分子篩層析,，利用各蛋白質分子大小不同分離。
44、,蛋白質分離常用的層析方法,離子交換層析,凝膠過濾,(gel filtration),又稱分子篩層析,親和層析,（,a,） 親和層析示意圖； （,b,） 洗脫曲線,親和層析,五、,利用蛋白質顆粒沉降行為不同可進行超速離心分離,超速離心法,(ultracentrifugation),既可以用來分離純化蛋白質也可以用作測定蛋白質的分子量。,蛋白質在離心場中的行為用,沉降系數(shù),(sedimentation coefficient, S),表示，沉降系數(shù)與蛋白質的密度和形狀相關 。,因為沉降系數(shù),S,大體上和分子量成正比關系，故可應用超速離心法測定蛋白質分子量，但對分子形狀的高度不對稱的大多數(shù)纖維狀蛋
45、白質不適用。,六、應用化學或反向遺傳學方法可分析多肽鏈的氨基酸序列,分析已純化蛋白質的氨基酸殘基組成,測定多肽鏈的氨基末端與羧基末端為何種氨基酸殘基,把肽鏈水解成片段，分別進行分析,測定各肽段的氨基酸排列順序，一般采用,Edman,降解法,一般需用數(shù)種水解法，并分析出各肽段中的氨基酸順序，然后經過組合排列對比，最終得出完整肽鏈中氨基酸順序的結果。,水解肽鏈的方法及特征,裂解劑,裂解位點,胰蛋白酶,Lys,、,Arg,（,C,）,胰凝乳蛋白酶,Phe,、,Tyr,、,Trp,（,C,）,彈性蛋白酶,Ala,、,Gly,、,Ser,、,Val,（,C,）,胃蛋白酶,Phe,、,Trp,、,Tyr,
46、（,N,）,溴化氰,Met,（,C,）,羥胺,AsnGly,通過核酸來推演蛋白質中的氨基酸序列,按照三聯(lián)密碼的原則推演出氨基酸的序列,分離編碼蛋白質的基因,測定,DNA,序列,排列出,mRNA,序列,七、應用物理學、生物信息學原理可進行蛋白質空間結構測定,二級結構測定,通常采用,圓二色光譜,(,circular dichroism,，,CD,),測定溶液狀態(tài)下的蛋白質二級結構含量。,-,螺旋的,CD,峰有,222nm,處的負峰、,208nm,處的負峰和,198 nm,處的正峰三個成分；而,-,折疊的,CD,譜不很固定。,三級結構測定,X,射線衍射法,(X-ray diffraction),和核磁共振技術,(nuclear magnetic resonance, NMR),是研究蛋白質三維空間結構最準確的方法。,同源模建,：將待研究的序列與已知結構的同源蛋白質序列對齊,補償氨基酸替補、插入和缺失,通過模建和能量優(yōu)化計算，產生目標序列三維結構。序列相似性越高，預測的模型也越準確。,折疊識別,：通過預測二級結構、預測折疊方式和參考其它蛋白的空間結構，從而產生目標序列的三維結構。,從無到有,：根據單個氨基酸形成二級結構的傾向，加上各種作用力力場信息，直接產生目標序列三維結構。,根據蛋白質的氨基酸序列預測其三維空間結構：,
生物化學蛋白質
