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1、1,醫(yī)療器械微生物限度檢驗,2,概述,微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法。,微生物限度檢查,細菌、真菌菌落數(shù),控制菌,3,概述,微生物：形體微小，結構簡單，通常要用光學顯微鏡和電子顯微鏡才能看清楚的生物 特點： 1、個體微小，一般0.1mm 2、構造簡單，有單細胞的，簡單多細胞 的，非細胞的 3、進化地位低 分類：原核類：二菌，四體（細菌、放線菌、螺旋體、支原體、立克次氏體、衣原體） 真核類：真菌，原生動物，顯微藻類 非細胞類：病毒，亞病毒,4,5,概述,醫(yī)療用品的分類 按醫(yī)療用品與人體接觸的性質(zhì)以及對人體使用安全性要求分三類： a) 類醫(yī)療用品：接觸人體
2、完整皮膚的醫(yī)療用品 b) 類醫(yī)療用品：接觸人體未破損粘膜的醫(yī)療用品 c) 類醫(yī)療用品：進入人體無菌組織、器官和血液 以及接觸破損皮膚和粘膜的醫(yī)療 用品,6,常用檢測標準,中華人民共和國藥典 2010年版二部附錄XI J “微生物限度檢查法” GB 15979-2002 一次性衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準附錄B ISO11737-1:2006 Sterilization of medical devices Microbiological methodsPart1: Determination of a population of microorganisms on products,7,8,實驗條件,無菌
3、操作技術 實驗環(huán)境 實驗器材,9,無菌操作技術,微生物學基礎 微生物實踐基礎 無菌操作意識,10,實驗環(huán)境,潔凈度10000級下的局部潔凈度100級的單向流空氣區(qū)域或隔離系統(tǒng)； 定期按GB/T16292-16294：2010醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測試方法的現(xiàn)行國家標準進行潔凈度驗證； 實驗中監(jiān)控：實驗時將制備好的營養(yǎng)瓊脂平板打開放于實驗臺上，至實驗結束收起，30 35培養(yǎng)48h，菌落平均數(shù)應小于1cfu/90mm。,11,實驗器具,儀器 超凈工作臺、光學顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、壓力蒸汽滅菌器、薄膜過濾裝置、比濁儀等。 用具 試管、注射器、三角瓶、刻度吸管、移液器、精密PH試
4、紙、濾膜、濾杯、剪刀、鑷子、無菌服、牛皮紙等。,12,實驗準備,實驗環(huán)境保證 實驗試液 培養(yǎng)基 滅菌方法,13,實驗環(huán)境保證,環(huán)境清潔，表面消毒（ 75%(V/V)乙醇、新潔爾滅(1:1000)溶液或其他適宜消毒溶液） 空氣過濾系統(tǒng)，紫外燈或臭氧空氣消毒儀,14,實驗試液,稀釋劑 1.0.9%氯化鈉溶液 2.pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液 3.pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液：調(diào)解pH至近中性，其中蛋白胨對細菌細胞有保護作用有利于菌落數(shù)及控制菌測定。 表面活性劑、中和劑或滅活劑 鑒定用試劑 1.靛基質(zhì)試液 2.1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液（氧化酶試液） 3.三氯甲烷 4.
5、1mol/l鹽酸試液,15,培養(yǎng)基,標準菌株處理及增菌用培養(yǎng)基 選擇性培養(yǎng)基 鑒別培養(yǎng)基,16,培養(yǎng)基,培養(yǎng)基的酸堿度應符合細菌生長要求。應按各種培養(yǎng)基要求準確測定調(diào)節(jié)pH值。多數(shù)細菌生長的適宜pH值為7.27.6。酵母菌霉菌（6.06.5）。調(diào)節(jié)可用1N HCl或NaOH。 培養(yǎng)基的滅菌時間和溫度，應按照各種培養(yǎng)基的規(guī)定進行，以保證滅菌效果及不損失培養(yǎng)基的必需營養(yǎng)成分。 制成的培養(yǎng)基應透明，以便觀察細菌生長性狀以及其他代謝活動所產(chǎn)生的變化。,17,滅菌方式,濕熱：115 121 ，15min30min 物品切勿立即取出置冷處，以免急速冷卻，使滅菌物品內(nèi)蒸氣冷凝造成負壓，以致染菌。 干熱：16
6、0 170 ，2h 適于耐高溫的玻璃、陶瓷或金屬器皿的滅菌。 滅菌程序需要經(jīng)過驗證。,18,計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查,細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)用培養(yǎng)基應進行培養(yǎng)基的適用性檢查，成品培養(yǎng)基、由脫水培養(yǎng)基或按處方配制的培養(yǎng)基均應檢查。,19,計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查,菌種 大腸埃希菌 CMCC（B）44 102 金黃色葡萄球菌 CMCC（B） 26 003 枯草芽孢桿菌 CMCC（B） 63 501 白色念珠菌 CMCC(F) 98 001 黑曲霉 CMCC(F) 98 003 驗證試驗所用的菌株傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術，以保證試驗菌株的生物
7、學特性。,20,計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查,菌液制備 取細菌新鮮培養(yǎng)物（一般18h24h，白念24h48h ，黑曲霉 57天 ），用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml 含菌數(shù)50cfu100cfu的菌懸液 （黑曲霉用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液）； 菌懸液在室溫下放置應在2小時內(nèi)使用，若保存在2 8可以在24小時內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2 8，在驗證過的貯存期內(nèi)使用。,21,計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查,培養(yǎng)基接種 金黃色葡萄球菌2個平皿 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 大腸埃希菌2個平皿 枯草芽孢桿菌2個平皿 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基 白色念珠菌2個平皿 黑典霉2個平皿 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：
8、白色念珠菌2個平皿 用相同的對照培養(yǎng)基替代被檢培養(yǎng)基做對照,22,計數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查,結果判定 若被檢培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)不小于對照培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)的70%，且菌落形態(tài)大小應與對照培養(yǎng)基上的菌落一致，判該培養(yǎng)基的適用性檢查符合規(guī)定。,23,樣品準備,供試品進入無菌實驗室前應作表面消毒，用適宜的消毒液對供試品容器表面進行徹底消毒。 檢驗數(shù)量：應從2個以上最小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少于4片。 一般應隨機抽取不少于檢驗用量（兩個以上最小包裝單位）的3倍量供試品。,24,樣品準備,檢驗量：除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10 g或10ml；化學膜劑100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品
9、的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗應增加20g或20ml（其中10g或10ml用于陽性對照試驗）。,25,供試液制備,液體供試品、固體、半固體或黏稠液供試品 取10ml或10g用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋至100ml，混勻，作為1：10的供試液。油劑可加入適量的無菌吐溫80使供試品分散均勻; 水溶性液體亦可用混合供試品原液作為供試液； 非水溶性供試品 ：乳化或萃取; 膜劑供試品 ：取供試品100cm2，剪碎，加pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100ml浸泡，振搖，作為1：10的供試液; 腸溶及結腸溶制劑供試品：取供試品10g ，加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液(用于腸溶
10、制劑)PH7.6無菌磷酸鹽緩沖液（用于結腸溶制劑）至100ml，置45水浴中，振搖，使溶解，作為1：10的供試液; 氣霧劑、噴霧劑供試品 ，經(jīng)處理后同第一項制備供試液; 貼劑供試品 具抑菌活性的供試品 ：培養(yǎng)基稀釋法 、離心沉淀法 、薄膜過濾法 、中和法;,26,細菌、霉菌及酵母菌計數(shù),實驗方法 傾注平皿法 薄膜過濾法 培養(yǎng)基 細菌總數(shù)：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 霉菌及酵母菌計數(shù)：玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄瓊脂培養(yǎng)基,27,細菌、霉菌及酵母菌計數(shù),培養(yǎng)和計數(shù) 除另有規(guī)定外，細菌培養(yǎng)3天，逐日點計菌落數(shù) 霉菌、酵母菌培養(yǎng)5天，逐日點計菌落數(shù) 必要時可延長至7天進行菌落計數(shù) 點計菌落數(shù)后，計算各稀
11、釋級供試液的平均菌落數(shù)，按菌數(shù)報告規(guī)則報告菌數(shù),28,細菌、霉菌及酵母菌計數(shù),方法驗證 （1）試驗組 平皿法：供試液1ml +1ml 試驗菌菌懸液，平行制備2個平皿，菌落計數(shù)； 薄膜過濾法：供試液，過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入1ml試驗菌，過濾，菌落計數(shù)； （2）菌液組 測定所加的試驗菌數(shù)； （3）供試品對照組 取規(guī)定量供試液，按菌落計數(shù)方法測定供試品本底菌數(shù)； （4）稀釋劑對照組 若供試液制備需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過濾等特殊處理時，應增加稀釋劑對照組，以考察供試液制備過程中微生物受影響的程度。稀釋劑+試驗菌菌懸液；,29,細菌、霉菌及酵母菌計數(shù),驗證試驗至少應進行3次獨立的
12、平行試驗，并分別計算各試驗菌每次試驗的回收率。 結果判斷 在3次獨立的平行試驗中，稀釋劑對照組的菌數(shù)回收率應均不低于70%； 若試驗組的菌數(shù)回收率均不低于70%，可照該供試液制備方法和計數(shù)法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數(shù)； 若任一次試驗中試驗組的菌數(shù)回收率低于70%，應采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法、薄膜過濾法、中和 法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。,30,細菌、霉菌及酵母菌計數(shù),1.平皿法 采用平皿法進行菌數(shù)測定時，應取適宜的連續(xù)23個稀釋級的供試液。 取供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入1520ml 溫度不超過45的溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰
13、紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄瓊脂培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。每稀釋級每種培養(yǎng)基至少制備2個平板。 陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液1ml，置無菌平皿中，注入培養(yǎng)基，凝固，倒置培養(yǎng)。每種計數(shù)的培養(yǎng)基各制備2個平板，均不得有菌生長。,31,細菌、霉菌及酵母菌計數(shù),營養(yǎng)瓊脂-細菌 玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基-霉菌,32,細菌、霉菌及酵母菌計數(shù),1.平皿法 菌數(shù)報告規(guī)則： 細菌、酵母菌宜選取平均菌落數(shù)小于300、霉菌宜選取平均菌落數(shù)小于100的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)； 以最高平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)的值報告1g、1ml或10cm2供試品中所含的菌數(shù)； 如果各稀釋級的平板均無菌落生長，或
14、僅是最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。,33,細菌、霉菌及酵母菌計數(shù),2. 薄膜過濾法 取相當于每張濾膜含1g或1ml供試品的供試液，加至適量的稀釋劑中，混勻，過濾。若供試品每1g或1ml 所含的菌數(shù)較多時，可取適宜稀釋級的供試液1ml ，過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜，沖洗后取出濾膜，菌面朝上貼于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或玫瑰紅鈉培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。每種培養(yǎng)基至少制備一張濾膜。 陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液1ml，照上述薄膜過濾法操作，作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。,34,細菌、
15、霉菌及酵母菌計數(shù),2. 薄膜過濾法 菌數(shù)報告規(guī)則：以相當于1g或1ml供試品的菌落數(shù)報告菌數(shù)；若濾膜上無菌生長，以1報告菌數(shù)（每張濾膜過濾 1g或1ml供試品），或1乘以稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)。,35,細菌、霉菌及酵母菌計數(shù),在特殊情況下，若營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上長有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上長有細菌，則應分別點計霉菌和酵母菌、細菌菌落數(shù)。然后將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的霉菌和酵母菌數(shù)或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基上的細菌數(shù)，與玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基中的霉菌和酵母菌數(shù)或營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的細菌數(shù)進行比較，以菌落數(shù)較高的培養(yǎng)基中的菌數(shù)為計數(shù)結果。,36,37,控制菌檢查法驗證,菌種（菌液制備同前） 大腸埃希菌 CMCC
16、（B）44 102 金黃色葡萄球菌 CMCC（B） 26 003 乙型副傷寒沙門菌CMCC（B） 50 094 銅綠假單胞菌 CMCC（B） 10 104 生孢梭菌 CMCC(B) 64 941,38,控制菌檢查法驗證,（1）試驗組 取規(guī)定量供試液及10cfu100cfu試驗菌加入增菌培養(yǎng)基中，依相應控制菌檢查法進行檢查。當采用薄膜過濾法時，取規(guī)定量供試液，過濾，沖洗，試驗菌應加在最后一次沖洗液中，過濾后，注入增菌培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。 （2）陰性菌對照組 設立陰性菌對照組是為了驗證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗組，驗證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門菌檢查法時的陰性對照菌采用金黃
17、色葡萄球菌；驗證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌，梭菌檢查法時的陰性對照菌采用大腸埃希菌。陰性對照菌不得檢出。 結果判斷 陰性菌對照組不得檢出陰性對照菌。若試驗組檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查；若試驗組未檢出試驗菌，應采用培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀法 、薄膜過濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。,39,大腸埃希菌檢驗,取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時，必要時可延長至48小時。 取上述培養(yǎng)物0.2ml，接種至含5ml MUG
18、培養(yǎng)基的試管內(nèi)，培養(yǎng)，于5小時、24小時在366nm紫外線下觀察，同時用未接種的MUG培養(yǎng)基作本底對照。若管內(nèi)培養(yǎng)物呈現(xiàn)熒光，為MUG陽性，不呈現(xiàn)熒光，為MUG陰性。觀察后，沿培養(yǎng)管的管壁加入數(shù)滴靛基質(zhì)試液，液面呈玫瑰紅色，為靛基質(zhì)陽性；呈試劑本色，為靛基質(zhì)陰性。本底對照應為MUG陰性和靛基質(zhì)陰性。,40,大腸埃希菌檢驗,MUG 靛基質(zhì)試驗,41,大腸埃希菌檢驗,如MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，判供試品檢出大腸埃希菌；如MUG陰性，靛基質(zhì)陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌；如MUG陽性、靛基質(zhì)陰性，或MUG陰性、靛基質(zhì)陽性，均應取膽鹽乳糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)物劃線于曙紅亞甲藍瓊脂培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上
19、，培養(yǎng)1824小時。 若平板上無菌落生長、或生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出大腸埃希菌 。若平板上生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，應進行分離、純化、染色鏡檢和適宜的生化試驗，確認是否為大腸埃希菌。,42,大腸埃希菌檢驗,大腸埃希菌菌落形態(tài)特征,43,大腸菌群檢驗,取含適量（不少于10ml）的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入1：10的供試液1ml（含供試品0.1g或 0.1ml）、1：100的供試液1ml（含供試品0.01g或 0.01ml ）、1：1000的供試液1ml（含供試品0.001g或 0.001ml），另取1支膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基加入稀釋液1ml作
20、為陰性對照管。培養(yǎng)1824小時。,44,大腸菌群檢驗,膽鹽乳糖發(fā)酵管若無菌生長、或有菌生長但不產(chǎn)酸產(chǎn)氣，判該管未檢出大腸菌群；若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，應將發(fā)酵管中的培養(yǎng)物分別劃線接種于曙紅亞甲藍培養(yǎng)基或麥康凱瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時。 若平板上無菌落生長，或生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征不符或為非革蘭陰性無芽孢桿菌，判該管未檢出大腸菌群；若平板上生長的菌落與下表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，且為革蘭陰性無芽孢桿菌，應進行確證試驗。,45,大腸菌群檢驗,大腸菌群落形態(tài)特征,46,大腸菌群檢驗,確證試驗 從上述分離平板上挑選45個疑似菌落，分別接種于乳糖發(fā)酵管中，培養(yǎng)2448小時。若產(chǎn)酸產(chǎn)氣，
21、判該乳糖發(fā)酵管檢 出大腸菌群，否則判未檢出大腸菌群。 根據(jù)大腸菌群的檢出管數(shù)，按下表報告1g或1ml供試品 中的大腸菌群數(shù)。,47,可能的大腸菌群數(shù)表,48,沙門菌檢驗,取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，培養(yǎng)1824小時。 取上述培養(yǎng)物1ml，接種于10ml四硫磺酸鈉亮綠培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時后，分別劃線接種于膽鹽硫乳瓊脂（或沙門、志賀菌屬瓊脂）培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂（或曙紅亞藍瓊脂）培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)1824小時（必要時延長至4048小時）。 若平板上無菌生長，或生長的菌落不同于下表所列的特征，判供試品未檢出
22、沙門菌。,49,沙門菌檢驗,沙門菌菌落形態(tài)特征,50,沙門菌檢驗,若平板上生長的菌落與上表所列的菌落形態(tài)特征相符或疑似，用接種針挑選23個菌落分別于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進行斜面和高層穿刺接種，培養(yǎng)1824小時，如斜面未見紅色、底層未見黃色；或斜面黃色、底層無黑色，判供試品未檢出沙門菌。否則，應取三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面的培養(yǎng)物進行適宜的生化試驗和血清凝集試驗，確認是否為沙門菌。,51,銅綠假單胞菌檢驗,取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基的
23、平板上，培養(yǎng)1824小時。 銅綠假單胞菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴散、表面濕潤，灰白色，周圍時有藍綠色素擴散。如平板上無菌落生長或生長的菌落與上述菌落形態(tài)特征不符，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。如平板上的菌落與上述菌落形態(tài)特征相符或疑似，應挑選23個菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824小時。取斜面培養(yǎng)物進行革蘭染色、鏡檢及氧化酶試驗。,52,銅綠假單胞菌檢驗,氧化酶試驗 取潔凈濾紙片置于平皿內(nèi)，用無菌玻棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，滴加新配置的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30秒內(nèi)培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。 若斜面培養(yǎng)物為非革蘭陰性無芽孢桿菌或
24、氧化酶試驗陰性，均判供試品未檢出銅綠假單胞菌。否則，應進行綠膿菌素試驗。 綠膿菌素試驗 取斜面培養(yǎng)物接種于PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24小時，加三氯甲烷35ml至培養(yǎng)管中，攪碎培養(yǎng)基并充分振搖。靜置片刻，將三氯甲烷相移至另一試管中，加入1mol/l鹽酸試液約1ml,振搖后，靜置片刻，觀察。若鹽酸溶液呈粉紅色，為綠膿菌素試驗陽性，否則為陰性。同時用未接種的PDP瓊脂培養(yǎng)基斜面同法作陰性對照，陰性對照試驗應呈陰性。 若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陽性，判供試品檢出銅綠假單胞菌。若上述疑似菌為革蘭陰性桿菌、氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陰性，應繼續(xù)進行適宜的生化試驗，確認是
25、否為銅綠假單胞菌。,53,金黃色葡萄球菌檢驗,取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）亞碲酸鈉（鉀）肉湯（或營養(yǎng)肉湯）培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824小時，必要時可延至48小時。取上述培養(yǎng)物，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)2472小時。若平板上無菌落生長或生長的菌落不同于下表所列特征，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。 若平板上生長的菌落與下表所列的菌落特征相符或疑似，應挑選23個菌落，分別接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)1824小時。取營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)物進行革蘭染色，并接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)1824
26、小時，作血漿凝固酶試驗。,54,金黃色葡萄球菌檢驗,金黃色葡萄球菌菌落形態(tài)特征,55,金黃色葡萄球菌檢驗,血漿凝固酶試驗 取滅菌小試管3支，各加入血漿和 無菌水混合液（1：1）0.5ml，再分別加入可疑菌株的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物（或由營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)物制備的濃菌懸液）0.5ml、營養(yǎng)肉湯或0.9%無菌氯化鈉溶液0.5ml，即為試驗管、陽性對照管和陰性對照管。將3管同時培養(yǎng)，3小時后開始觀察直至24小時。陰性對照管的血漿應流動自如，陽性 對照管血漿應凝固，若試驗管血漿凝固者為血漿凝固酶試驗陽性，否則為陰性。如陽
27、性對照管或陰性對照管不符合規(guī)定時，應另制備血漿，重新試驗。,56,金黃色葡萄球菌檢驗,若上述疑似菌為非革蘭陽性球菌、血漿凝固酶試驗陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。,57,梭菌檢驗,取供試液10ml （相當于供試品1g，1ml）2份，其中1份置80保溫10分鐘后迅速冷卻。上述2份供試液直接或處理后分別接種至100ml的0.1%新鮮庖肉培養(yǎng)基中。各培養(yǎng)基管在厭氧條件下培養(yǎng)48小時。再取上述培養(yǎng)物0.2ml，涂抹接種于含慶大霉素的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基平板上，在厭氧條件下培養(yǎng)4872小時。若平板上無菌落生長，判供試品未檢出梭菌；若平板上有菌落生長，應挑選23個菌落分別進行革蘭染色和過氧化氫酶試驗。
28、過氧化氫酶試驗 取上述平板上的菌落，置潔凈玻片上，滴加3%過氧化氫試液，若菌落表面有氣泡產(chǎn)生，為過氧化氫酶試驗陽性，否則為陰性。 若上述可疑菌落為革蘭陽性梭菌，有或無卵圓形或球形的芽孢，過氧化氫酶陰性，判供試品檢出梭菌，否則判供試品未檢出梭菌。,58,白色念珠菌檢驗,取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml、10cm2），直接或處理后接種至適量（不少于100ml）的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4872小時，取上述培養(yǎng)物，劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時。 菌落特征：乳白色，偶見淡黃色，表面光滑有濃酵母氣味，培養(yǎng)時間稍久則菌落增大，顏色變深，質(zhì)地變硬或有皺褶。 若平板上無
29、菌落生長或生長的菌落不同于上述特征，判供試品未檢出白色念珠菌。 若平板上生長的菌落與上述特征相符或疑似，應挑選23個菌落，分別接種念珠菌顯色培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)2448小時。若平板上無綠色或翠綠色的菌落生長，判供試品未檢出白色念珠菌。 若有綠色或翠綠色的菌落生長，則挑取相符或疑似菌落接種于1%聚山黎脂80-玉米瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)2448小時，進行染色鏡檢及芽管試驗。 若上述疑似菌為非革蘭陽性菌，顯微鏡下未見厚膜孢子、假菌絲、芽管，判供試品未檢出白色念珠菌。,59,結果判斷,供試品檢出控制菌或其他致病菌時，按一次檢出結果為準，不再復試。 供試品的細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，應從同一批樣品中隨機抽樣，獨立復試兩次，以3次結果的平均值報告菌數(shù)。 眼用制劑檢出霉菌和酵母菌數(shù)時，須以兩次復試結果均不得長菌，方可判供試品的霉菌和酵母菌數(shù)符合該品種項下的規(guī)定。 若供試品的細菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)及控制菌三項檢驗結果均符合該品種項下的規(guī)定，判供試品符合規(guī)定；若其中任何一項不符合該品種項下的規(guī)定，判供試品不符合規(guī)定。,60,謝謝大家！,知識回顧Knowledge Review,
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