免疫檢驗自動化儀器分析

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1、第二十章 免疫檢驗自動化儀器分析,免疫檢驗自動化 （automation of immunoassays) 是將免疫學反應檢測過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號檢測、數據處理、打印報告和檢測后的儀器清洗等步驟由計算機控制，自動化進行。,第一節(jié) 自動化免疫濁度分析系統(tǒng),免疫濁度分析的基本原理是：抗原、抗體在特定的電解質溶液中反應，形成小分子免疫復合物（19S），使反應液出現濁度。在抗體稍微過量且固定的情況下，形成的免疫復合物量隨抗原量的增加而增加，反應液的濁度亦隨之增大，即待測抗原量與反應溶液的濁度呈正相關。,一定波長的入射光線通過抗原抗體反應后的溶液時，被其中的免疫復合物微粒

2、吸收、反射和折射而減弱，在一定范圍內，吸光度與免疫復合物量呈正相關，而形成的免疫復合物量與參與反應的抗原和抗體的量呈函數關系。與已知濃度的抗原標準品比較，可確定標本中抗原含量。,一、免疫透射比濁法,（一）原理：,1.將待檢標本和抗原參考品作適當稀釋。,（二）儀器工作過程,2.將待測標本和標準抗原溶液（5個濃度抗原標準品）與適當過量的抗血清混合，在一定條件下，抗原抗體反應完成后，在340nm處測定各管吸光度。,3.按log-logit轉換或y=ax3+bx2+cx+d方程進行曲線擬合，制備劑量-反應曲線，由計算機處理，計算出抗原濃度。,（三）方法評價,優(yōu)點: 靈敏度高，穩(wěn)定性好，操作簡便，結果準

3、確,不足: 抗體用量較大； 溶液中存在的抗原抗體復合物分子應足夠大 透射比濁測定在抗原抗體反應的第二階段，檢 測需在抗原抗體反應達到平衡后進行，耗時較長。,用抗體致敏的大小適中、均勻一致的膠乳顆粒（一般為0.2 m），在遇到相應抗原時，膠乳顆粒上的抗體與抗原特異結合，引起膠乳顆粒凝聚 ，使透射光和散射光即出現顯著變化。如圖所示：a為單個膠乳顆粒不阻礙光線透過，b為抗原抗體結合形成的凝聚膠乳大顆粒使透射光減弱或散射光增強。,二、免疫膠乳比濁法,（一）原理：,（二）方法評價,本法敏感度大大高于普通比濁法，可達ng/L水平，操作簡便，易自動化；血清中的類風濕因子(RF)可與IgG Fc段結合，使Ig

4、G致敏膠乳顆粒出現非特異性凝集，用F(ab)2片段代替IgG既可消除此干擾，又可克服IgG致敏膠乳的自凝現象；免疫膠乳輕度自凝或抗體活性降低會嚴重影響結果。,粒子對光線的散射作用是溶液中的微粒子受到光線照射后，微粒子對光線產生反射和折射而形成散射光。懸浮微粒對光散射形成的散射光強度與微粒的大小、數量、入射光的波長和強度、測量角度等因素密切相關，其公式如下：,三、免疫散射比濁法,(一) 原理,式I 中為與入射光成角處散射光強度；和I0為入射光的波長和強度；dn/dc為校正因子，反映了溶液折射指數和顆粒濃度的變化；M為顆粒分子量；c為濃度；N為阿佛加德指數；為顆粒到檢測器的距離；為散射光與入射光的

5、夾角（散射夾角）。,II042（dn/dc) 2 Mc(1+cos) N24,定時散射比濁法是在保證抗體過量的情況下，加入待測抗原，此時反應立即開始，在反應的第一階段，溶液中產生的散射光信號波動較大，所獲取的信號計算出的結果會產生一定的誤差。定時散射比濁法是避開抗原抗體反應的不穩(wěn)定階段，即散射光信號在開始反應7.5s2min內的第一次讀數，專門在抗原抗體反應的最佳時段進行讀數，將檢測誤差降到最低。,(二)定時散射比濁法（fixed time nephelometry）,定時散射比濁法測定原理示意圖,1. 儀器測定技術要點,(1) 抗原抗體預反應階段 (2) 反應階段(3) 信號檢測,2. 抗原

6、過量檢測,(1) 抗體適當過量 (2) 對抗原過量進行閾值限定,BN ProSpec全自動特定蛋白分析儀,速率散射比濁法是抗原抗體結合反應的動力學測定法。所謂速率是指抗原抗體反應在單位時間內形成免疫復合物的量（不是免疫復合物累積的量），連續(xù)測定各時間復合物形成的速率與其產生的散射光信號聯系在一起，形成動態(tài)的速率散射比濁法，每項檢測僅12min即可完成。,(三)速率散射比濁法（rate nephelometry）,儀器測定技術要點,開啟機器，進行定標 反應階段 抗原過量檢測,抗原抗體復合物形成的速率,抗原抗體反應速率的動態(tài)變化,IMMAGE全自動特定蛋白分析儀,(三)方法評價,散射比濁法是目前臨

7、床應用較多的一種方法，本法自動化程度高，具有快速、靈敏、準確、精密等優(yōu)點。采用抗原過量檢測方法，保證了結果的準確性。但儀器和試劑價格比較貴, 對抗體的質量要求很高。,1.抗原抗體比例 2.抗體的質量 3.增濁劑的使用,（一）免疫比濁分析的影響因素,四、免疫比濁分析的影響因素和臨床應用,4.偽濁度 5.入射光光源和波長 6.結果報告中的計量單位 7.標準曲線制備與質量控制,（二）臨床應用,免疫比濁分析法主要用于檢測免疫球蛋白IgG、IgA、IgM、鏈、鏈、免疫球蛋白亞類；補體C3、C4；血漿蛋白如前白蛋白(PAB)、白蛋白(ALB)、1-抗胰蛋白酶(1-AT)、2-微球蛋白(2-MG)、轉鐵蛋白

8、(TRF)、銅藍蛋白(CER)、結合珠蛋白(HP)、，C-反應蛋白(CRP)、載脂蛋白ApoAI、ApoB、脂蛋白(a)、類風濕因子(RF)、尿微量蛋白系列和某些治療性藥物濃度等。,第二節(jié)自動化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng),自動化發(fā)光免疫分析儀主要由樣本盤、試劑盤(盒)、溫育反應系統(tǒng)、固相載體分離清洗系統(tǒng)、信號檢測系統(tǒng)和計算機數據處理、控制系統(tǒng)組成。,吖啶酯標記的化學發(fā)光免疫分析儀是一種用發(fā)光劑直接標記抗體或抗原的一類免疫分析法。該儀器利用化學發(fā)光技術和磁性微粒子分離技術，以吖啶酯為化學發(fā)光劑，以細小的順磁性微粒為固相載體。其測定原理與雙抗體夾心法、雙抗原夾心法和競爭結合法等相同。,一、吖啶酯標記化學發(fā)

9、光免疫分析儀,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,Y,順磁性微粒示意圖,磁微粒技術,磁微粒在電磁場中分離,磁微粒標記抗體,發(fā)光,Y,Y,Y,磁微粒,被測抗原,+,抗體,+,帶丫啶酯標記物抗體,沖洗后,雙抗體夾心法,直接化學發(fā)光的機理,（1）加入酸性H2O2（pH10）,儀器測定技術要點,抗原抗體結合 洗滌、分離 加入氧化劑發(fā)光 信號檢測,吖啶酯標記化學發(fā)光免疫測定示意圖,ACS：180 SE和ACSCENTAUR化學發(fā)光免疫分析儀,ACS：180 SE,ACSCENTAUR,ci8200,i2000sr,酶聯發(fā)光免疫分析儀是用參與催化某一化學發(fā)光或熒光反應的酶來標記抗原或抗體，在抗原抗

10、體反應后，加入底物(發(fā)光劑)，由酶催化和分解底物發(fā)光，通過光信號的強弱來進行被測物的定量。 常用的標記酶有辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶(ALP)，常用的發(fā)光底物有魯米諾、AMPPD和4-MUP等。,二、酶聯發(fā)光免疫分析儀,該儀器采用辣根過氧化物酶（HRP）標記抗原或抗體、以塑料錐形小管為固相載體，魯米諾為化學發(fā)光劑，還利用增強劑使化學發(fā)光強度增加、時間延長。,辣根過氧化物酶標記的化學發(fā)光免疫分析儀,魯米諾是一種還原劑，在堿性溶液中被H2O2氧化產生魯米諾衍生物（激發(fā)態(tài)）。它以光量子輻射形式返回基態(tài)時，發(fā)出微綠色可見光。,魯米諾增強化學發(fā)光的原理,辣根過氧化物酶標記的化學發(fā)光免疫測定示意

11、圖,Vitros ECi全自動增強化學發(fā)光酶免分析儀, 堿性磷酸酶標記的化學發(fā)光免疫分析儀,該儀器是以堿性磷酸酶標記抗原或抗體，以順磁性微粒子為固相載體，用AMPPD作為化學發(fā)光劑進行測定的自動化儀器。,AMPPD發(fā)光反應原理示意圖,抗原抗體結合 洗滌、分離 加入AMPPD發(fā)光劑 信號檢測,儀器測定技術要點,堿性磷酸酶標記的化學發(fā)光免疫測定示意圖,Access全自動酶標記化學發(fā)光免疫分析儀,UniCelDxI 800,IMMULITE 2000型全自動酶標記化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng),（三）堿性磷酸酶標記的微粒子熒光免疫分析儀,該儀器以堿性磷酸酶標記抗原或抗體，以塑料微粒為固相載體包被抗體（或抗原）

12、，以4-甲基傘型酮磷酸鹽（4-MUP）作為酶促反應的熒光基質（底物），底物被酶水解后，脫磷酸根基團，形成4-甲基傘型酮(4-MU)，用360nm激發(fā)光照射，發(fā)出450nm的熒光。,4-甲基傘型酮磷酸鹽（4-MUP）反應原理示意圖,儀器測定技術要點,抗原抗體結合 洗滌、分離 加入底物4-MUP 信號檢測,堿性磷酸酶標記的微粒子熒光免疫測定示意圖,AXSYM全自動酶標記熒光免疫分析儀,AIA-1800型全自動酶標記熒光免疫分析儀,電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA）是一種在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應，它包括電化學和化學發(fā)光兩個過程。電化學發(fā)光免疫分析儀是采用電化學發(fā)光技術，生物素放大技術

13、，以順磁性微粒為固相載體，用三聯吡啶釕標記抗原或抗體，三丙胺(TPA)為電子供體，而設計的一種自動化分析儀器。電化學發(fā)光穩(wěn)定、持續(xù)時間長，易于控制并可根據待測分子的大小設計成多種反應模式如夾心法、競爭法等。,三、 電化學發(fā)光免疫分析儀,電化學發(fā)光劑發(fā)光的反應原理,三聯吡啶釕Ru(bpy)3 2+分子結構圖,時間分辨熒光免疫分析儀是用鑭系元素標記抗原或抗體作為示蹤物，與時間分辨測定技術結合而制造出來的一種自動化分析儀。熒光偏振免疫測定是一種均相熒光免疫測定法，常采用抗原抗體競爭反應原理，適用于小分子半抗原（如藥物濃度）的檢測。全自動酶聯免疫分析儀是由多個模塊組成，用一臺計算機、一套操作系統(tǒng)實現了

14、從標本稀釋、加樣到酶標板孵育、洗滌、加試劑、再孵育、洗滌、酶標板讀數和結果打印自動化。其結果是減輕了勞動強度，縮短了試驗時間，提高了工作效率，為全面實現實驗室自動化打下了基礎。,磁性微粒直徑2.8m，表面的凸凹使包被面積放大。磁性微粒體積小，懸浮于反應體系中，形成均一穩(wěn)定的液相，在磁場中易于分離。,儀器測定技術要點,抗原抗體結合 電化學發(fā)光反應 光信號檢測 檢測完畢,電化學發(fā)光免疫測定示意圖,電化學發(fā)光免疫測定工作示意圖,AMPPD特性,堿性PH環(huán)境下，非酶解性的水解很低熱穩(wěn)定性好PH9時酶解速度最快，PH9.5時信噪比最低發(fā)光為持續(xù)型，15min達到高峰，60min內強度維持不變,相對發(fā)光單

15、位,00 5 10 55 60,時間（分鐘）,發(fā)光圖譜連續(xù)，穩(wěn)定。 允許多次記數，取均值作為結果。,AMPPD發(fā)光圖譜,ACCESS分析簡要流程,ACCESS,專利，獨有技術磁性微粒子技術：d7 超聲波清洗系統(tǒng)：交叉污染率300臺 150臺開展項目 42 25 38連續(xù)檢測數 600 260 300消耗品隨機更換 可 不可 不可試劑穩(wěn)定性 1年 3個月 1年試劑定貨周期 1周 1月以上 3月以上試劑上機保存時間 到效期 8H 4周性能價格比 高 低 中,高特異經典免疫學原理，單克隆抗體技術大分子采用夾心法分析小分子采用競爭法分析專利的磁性分離技術,ACCESS 系統(tǒng)特點,高靈敏采用最靈敏、最穩(wěn)

16、定的ALP-Dioxetane放大系統(tǒng)采用最持久最穩(wěn)定的發(fā)光劑AMPPD 采用磁性微粒子技術(d7) 擴大包被面積以TSH為例， 檢測限達0.003IU/ml，為第三代TSH,ACCESS 系統(tǒng)特點,高穩(wěn)定發(fā)光信號穩(wěn)定，持續(xù)高質量原廠試劑, 無需預處理穩(wěn)定，持久的標準曲線，有效期長達28天以上機上試劑冷藏系統(tǒng)，試劑3度保存，有效期長多層覆膜試劑盒，確保試劑穩(wěn)定,ACCESS 系統(tǒng)特點,高準確超靈敏光電倍增管檢測發(fā)光信號發(fā)光穩(wěn)定后，記錄10次/s，取均值為結果超聲波清洗系統(tǒng)，嚴格防止交叉污染(1ppm)系統(tǒng)自動QC管理 (Levy-Jennings),ACCESS 系統(tǒng)特點,ACCESS 系統(tǒng)特

17、點,全自動，連續(xù)，任選，隨機式檢測速度100測試/小時，第一個結果需15分鐘利用條碼連續(xù)加入標本，一次上機60個，運行中 利用條碼連續(xù)加入試劑，一次上機24個，運行中不停機加入各種耗品，耗品預警功能24小時待機，確保急診檢測 HCG; Myoglobin; Troponin計算機控制，形象化軟件，Host Query功能,ACCESS 試劑項目,心血管動力學 Accu TnI糖尿病甲狀腺激素 第三代TSH血液病毒 內分泌系統(tǒng) 性激素感染性疾病貧血腫瘤因子 游離PSA過敏原代謝疾病治療藥物監(jiān)測,可用于內分泌激素類、腫瘤標志物類、心肌標志物類、病毒標志物類、治療性藥物濃度、骨代謝指標和貧血類等方面

18、的檢測，是目前免疫化學應用最為廣泛的新技術。,四、在臨床免疫檢測中的應用,第三節(jié) 自動化熒光免疫分析系統(tǒng),熒光免疫自動化分析主要是將抗原抗體結合反應與熒光物質發(fā)光分析和計算機技術有機結合的一項自動化免疫分析技術。根據抗原抗體反應后是否需要進行固相分離，分為均相和非均相兩類。非均相熒光免疫測定主要有時間分辨熒光免疫測定法；均相熒光免疫測定主要有熒光偏振免疫測定法。,時間分辨熒光免疫測定（time resolved fluorescence immunoassay, TRFIA）是以鑭系元素標記抗原或抗體作為示蹤物，并與時間分辨測定技術相結合，建立起來的一種新型非放射性微量分析技術，具有靈敏度高，

19、鑭系元素發(fā)光穩(wěn)定，熒光壽命長，不受樣品自然熒光干擾，標準曲線范圍寬等特點，已在臨床實驗室廣泛使用。,一、時間分辨熒光免疫分析儀,Eu3+元素激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間的stokes位移,（一）、原理,時間分辨Eu3+元素熒光信號測量示意圖,（二）儀器測定技術要點, 抗原抗體結合 加入Eu3+螯合抗體 加入酸性增強液 4. 信號檢測,固相雙抗體夾心TRFIA檢測過程示意圖,增強液(enhancement solution)，使Eu3+抗體抗原復合物的PH值降低至23，以利于Eu3+從復合物上完全解離下來，游離的Eu3+為增強液中的另一種螯合劑所螯合，在協(xié)同劑等其它成分的作用下，與增強液中的-二酮體生

20、成一個Eu3+在其內部的保護性膠態(tài)分子團，這是一個新的具有高強度熒光的穩(wěn)定螯合物，它在紫外光的激發(fā)下發(fā)射很強的熒光，信號的增強效果可達上萬倍，該技術使用了解離增強步驟，并且采用了前后兩種不同的螯合劑，前一種用于Eu3+與抗體標記，后一種用于與解離下來的Eu3+螯合成新的強熒光發(fā)射分子，因此，又將該技術稱為解離增強鑭系元素熒光免疫(dissociation-enhanced lanthanide fluoroimmunoassay, DELFIA),（三）解離增強原理：,auto DELFIA全自動時間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng),1. TRFIA分析用的酸性增強液易受環(huán)境、試劑、容器等里面的鑭系元素污

21、染，使本底升高，所用試劑和器材應盡量防塵。 2.TRFIA分析用載體最常用的是聚苯乙烯微96孔板，其熒光本底低，并有洗滌微孔板的自動裝置，但不同廠家生產的微孔板，所產生的熒光有很大差異，應選擇應用。,（四）注意事項,熒光偏振免疫測定(fluorescence polarization immunoassay，FPIA)，為一種均相熒光免疫測定方法，其利用熒光物質在溶液中被單一平面的偏振光照射后，可吸收光能而產生另一單一平面的偏振發(fā)射熒光，該熒光強度與熒光 標記物質在溶液中旋轉的速度與分子大小呈反比，常采用抗原-抗體競爭反應原理，適用于小分子半抗原（如藥物濃度）的檢測。,二、熒光偏振免疫分析儀,

22、光的本質是電滋波，光是各個方向電滋波的混合物，當光線通過偏振濾光片后，形成只有一個方向的電滋波，稱之為偏振光。熒光物質經單一平面的偏振光（藍色光，485nm）激發(fā)后，可吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，在其恢復至基態(tài)時，釋放能量并發(fā)射出單一平面的偏振熒光（綠色光，525nm550nm） 。偏振熒光強度與熒光物質分子在液相中轉動的速度呈反比，即分子大轉動速度慢，熒光強度大，分子小轉動速度快，熒光強度小。,(一) 原理,偏振光和偏振熒光發(fā)生示意圖,熒光偏振免疫測定工作原理示意圖,1. 抗原抗體反應 2.偏振熒光強度測定,（二） 儀器測定技術要點,1.FPIA的結果好壞取決于熒光素標記的好壞、激發(fā)態(tài)熒光的平均壽命

23、、抗原的相對分子量和復合物的特性等因素。2.為提高FPIA靈敏度，可用除蛋白劑對標本進行預處理，除去干擾成分。,（三）注意事項,第四節(jié) 自動化酶聯免疫分析系統(tǒng),根據全自動酶聯免疫分析系統(tǒng)的處理模式，人們通常將全自動酶免分析儀分成二類，一類為分體機，一類為連體機。分體機是由“前處理系統(tǒng)”即全自動樣本處理工作站和“后處理系統(tǒng)”即全自動酶免分析儀兩個獨立的部分組成。連體機是由多個模塊組成，使用一臺計算機、一套操作系統(tǒng)實現了從標本稀釋、加樣到酶標板孵育、洗滌、加試劑、再孵育、洗滌、讀數和結果打印全自動進行。,（一）儀器組成和性能,1.條形碼識別系統(tǒng) 2.樣本架和加樣系統(tǒng) 3.試劑架 4.溫育系統(tǒng),5.

24、液路系統(tǒng) 6.洗板系統(tǒng) 7. 酶標板讀數儀 8.自動裝載傳遞系統(tǒng) 9. 計算機管理和信息系統(tǒng),全自動酶免分析儀中的連體機是將樣本處理工作站和全自動酶免分析儀聯合起來，工作速度快，自動化程度高，適合大批量樣本的處理，如血站系統(tǒng)。分體機，由于它有一個獨立的全自動樣本處理站，加樣速度快，適合試驗項目變化多、樣本批量不等的臨床實驗室。,（二）儀器評價,采用流水線式操作,加樣,洗板,常用英語單詞,Reagent :試劑Sample：標本Calibration：校準，定標Maintenance：維修，保養(yǎng)Alarm:報警Rack：試管架,1. 什么是免疫檢驗自動化？應用哪些技術？優(yōu)點是什么？2. 免疫濁度

25、分析的原理是什么？有哪些臨床應用？3. 免疫膠乳比濁法和免疫散射比濁法的原理是什么？4. 定時散射比濁法和速率散射比濁法的測定原理，其抗原過量檢測有什么不同點？5. 免疫比濁分析的影響因素有哪些？6. 吖啶酯標記的化學發(fā)光免疫分析儀技術要點是什么？7. 酶聯發(fā)光免疫分析儀的原理，有哪幾種類型？各有什么特點？8. 電化學發(fā)光免疫分析儀測定的技術要點是什么？9. 時間分辨熒光免疫分析儀測定的技術要點是什么？注意事項有哪些？10. 全自動酶免分析儀的組成成分有哪些？優(yōu)點是什么？,思考題,免疫檢驗自動化是將免疫檢驗過程中的取樣、加試劑、混合、溫育、固相載體分離、信號檢測、數據處理、打印報告和儀器清洗等步驟由計算機控制，儀器自動化進行。定時散射比濁法是在保證抗體過量的情況下，加入待測抗原，在抗原抗體反應的第一階段，溶液中產生的散射光信號波動大，所獲取的信號不穩(wěn)定，定時散射比濁法避開這一階段，專門測定抗原抗體反應的最佳時段，使檢測誤差降到最低。,小結,吖啶酯標記的化學發(fā)光免疫分析儀是一種用發(fā)光劑直接標記抗體或抗原，以磁性微粒為固相載體的一種免疫分析法，吖啶酯發(fā)光只需加入氧化劑和pH糾正液，不需要酶催化。酶聯發(fā)光免疫分析儀是用參與催化某一化學發(fā)光或熒光反應的酶來標記抗原或抗體，在抗原抗體反應后，加入底物(發(fā)光劑)，由酶催化和分解底物發(fā)光，通過光信號的強弱來進行定量。,