基因工程之基因操作的工具酶培訓課件

單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,3.3 DNA聚合酶,DNA聚合,酶,酶,：能夠催化,脫,脫氧核糖核,苷,苷酸連續(xù)加,到,到雙鏈DNA分子引物,鏈,鏈的游離3,-OH末,端,端，使核苷,酸,酸發(fā)生聚合,作,作用，而不,從,從模板上解,離,離。,反應特點,：,(1)以,四,四種三磷酸,脫,脫氧核糖核,苷,苷（dNTP）為底物,(2)反,應,應需要模板,的,的指導，加,入,入的核苷酸,由,由模板鏈所,決,決定,(3)聚,合,合反應需要,有,有引物存在,，,，且引物要,有,有3-OH游離基團,(4)DNA鏈的生,長,長方向為5,3,(5)產(chǎn),物,物DNA鏈,的,的性質(zhì)與模,板,板相同（半,保,保留復制）,DNA聚合,酶,酶只能在已,有,有的核酸鏈,上,上延伸DNA鏈，而不,能,能從無到有,開,開始DNA,鏈,鏈的合成。,種類,：,到目前為止,，,，已從,E.coli,中發(fā)現(xiàn)了Pol I、Pol II、PolIII三,種,種DNA聚,合,合酶。其,中,中PolI 和Pol II的,主,主要功能是,參,參與DNA,的,的修復過程,，,，PolIII與DNA的復制,有,有關。三種,聚,聚合酶中，,只,只有PolI 同分,子,子克隆關系,密,密切。,3.3.1,大,大腸桿菌DNA聚合,酶,酶 I,（,E.coli,DNA Pol I）,DNA Pol I是,從,從大腸桿菌,細,細胞中分離,得,得到的，該,酶,酶是由單一,多,多肽組成的,球,球蛋白，MW=109000，直,徑,徑=65,DNA Pol I已,得,得到高度純,化,化，從100 kg大,腸,腸桿菌中可,以,以分離到約500 mg純化的酶,蛋,蛋白。每個,成,成熟的大腸,桿,桿菌細胞中,約,約有400,個,個分子的Pol I。,1.DNA PolI在空間,結,結構上有三,個,個位點：,(1)DNA模板結,合,合位點,結,結合模板,(2)核,苷,苷酸-磷酸,結,結合位點,結合引物,(3)dNTP結合,位,位點結,合,合底物,2.DNA PolI是一種,多,多功能酶：,(1)5,3的聚合,酶,酶活性,催化單核苷,酸,酸逐個地結,合,合到DNA,模,模板的3-OH末端,，,，沿著引物,的,的3-OH方向按模,板,板順序從5,3延伸。,每分子DNA polI每分鐘,可,可以催化約1000個,核,核苷酸的聚,合,合。,(2)5,3的外切,酶,酶活性,只作用于雙,鏈,鏈DNA（dsDNA,）,），從5,端切割下,一,一個個單核,苷,苷酸。,(3)3,5的外切,酶,酶活性,能從游離的3末端降,解,解單鏈DNA（ssDNA）成為,單,單核苷酸，,通,通常對雙鏈DNA不作,用,用。,在正常聚合,條,條件下，該,酶,酶對dsDNA的3,5外切酶,活,活性受到5,3聚合酶,活,活性的抑制,。,。但一旦出,現(xiàn),現(xiàn)錯配堿基,時,時，聚合反,應,應立即停止,，,，由3,5外切酶,迅,迅速除去錯,誤,誤進入的核,苷,苷酸，然后,聚,聚合反應才,得,得以繼續(xù)進,行,行下去。所,以,以3,5核酸外,切,切酶活力被,認,認為起著校,對,對功能，對DNA復制,的,的忠實性極,為,為重要。,3.,E.coli,DNA Pol I在,基,基因工程中,的,的用途:,(1)可用于填補dsDNA,上,上的缺口，,以,以便有效地,進,進行DNA,重,重組,(2)用,于,于DNA序,列,列分析,(3)用,于,于制備DNA探針,在DNA分,子,子的單鏈缺,口,口上，DNA聚合酶I,的,的5,3核酸外,切,切酶活性和,聚,聚合作用可,以,以同時發(fā)生,。,。當外切酶,活,活性從缺口,的,的5一側,移,移去一個5,核苷酸后,，,，聚合作用,就,就會在缺口,的,的3一側,補,補上一個新,的,的核苷酸。,隨,隨著反應的,進,進行，5,一,一側的核苷,酸,酸不斷地被,移,移去，3,一,一側的核苷,酸,酸又按序地,增,增補，于是,缺,缺口便沿著DNA分子,按,按合成的方,向,向移動,缺口平移,（NickTranslation）。,應用缺口平,移,移法制備DNA雜交探,針,針，其典型,的,的反應體系,是,是：在25,l總體積中,含,含有1,g純化的特,定,定的DNA,片,片段，并加,入,入適量的DNaseI、polI、,32,P,dNTP和,未,未標記的dNTP。,脫氧核糖核,苷,苷酸酶 I,（,（DNase I）是,一,一種內(nèi)切酶,，,，它能夠水,解,解單鏈或雙,鏈,鏈DNA，,形,形成帶有5,-磷酸末,端,端的單（寡,）,）核苷酸。,由于,32,P,dNTP比,較,較昂貴，所,以,以一般都采,用,用低濃度的,32,P,dNTP（2,mol/L,）,）和高濃度,的,的未標記的dNTP（20,mol/L,）,）。而且就,大,大多數(shù)實驗,的,的要求，使,用,用一種,32,P,dNTP就,足,足夠了，其,他,他3種均可,采,采用未標記,的,的dNTP,，,，或是用適,量,量的未標記,的,的dNTP,稀,稀釋每種,32,P,dNTP。,改變反應體,系,系中DNase I的,數(shù),數(shù)量，可以,控,控制,32,P,dNTP的,參,參入程度，,一,一般希望有30%左右,的,的,32,P,dNTP參,入,入DNA鏈,。,。,3.3.2,大,大腸桿菌DNA聚合,酶,酶 I的Klenow,片,片段,（,E.coli,DNA Pol IKlenow fragment,）,）,用蛋白酶將DNA Pol I,作,作有限水解,，,，可得到分,子,子量為75000 dal和36000 dal的兩個,片,片段，大片,段,段即稱為Klenow,片,片段，它具,有,有5,3的聚合,酶,酶活性和3,5的核酸,外,外切酶活性,，,，但失去了,全,全酶的5,3的核酸,外,外切酶活性,。,。,Klenow聚合酶可,以,以標記DNA片段末端,（,（5延伸,末,末端）。,對于限制性,核,核酸內(nèi)切酶EcoRI切割后形成,的,的5延伸,末,末端可用,32,P,dATP標,記,記：,而BamHI切割后形,成,成的5延,伸,伸末端可用,32,P,dGTP標,記,記：,3.3.3T,4,DNA聚合,酶,酶,是從T,4,噬菌體感染,的,的大腸桿菌,中,中分離純化,的,的一種特殊,的,的DNA聚,合,合酶。,1.T,4,DNA聚合,酶,酶也是一種,多,多功能酶：,(1)5,3的聚合,酶,酶活性,(2)3,5的外切,酶,酶活性,其外切酶活,性,性比,E.coli,DNA Pol I,的,的活性高200倍。,(3)取代反應活,性,性,如果在反應,混,混合物中僅,存,存在一種dNTP，則,此,此酶的3,5外切酶,活,活性將從dsDNA,的,的3末端,降,降解，直到,互,互補于這個dNTP的,堿,堿基出現(xiàn)為,止,止，然后在,這,這一位置發(fā),生,生取代反應,。,。,2.T,4,DNA,聚,聚,合,合,酶,酶,在,在,基,基,因,因,工,工,程,程,中,中,的,的,應,應,用,用,(1),以,以,填,填,充,充,反,反,應,應,標,標,記,記,帶,帶,有,有5,延,延,伸,伸,末,末,端,端,的,的dsDNA,片,片,段,段,(2),將,將DNA,的,的3,延,延,伸,伸,末,末,端,端,切,切,成,成,平,平,末,末,端,端,(3),以,以,取,取,代,代,反,反,應,應,標,標,記,記,帶,帶,有,有3,延,延,伸,伸,末,末,端,端,或,或,平,平,末,末,端,端,的,的dsDNA,片,片,段,段,(4),以,以,部,部,分,分,消,消,化,化dsDNA,法,法,標,標,記,記DNA,片,片,段,段,作,作,為,為,雜,雜,交,交,探,探,針,針,（,（,鏈,鏈,特,特,異,異,的,的,探,探,針,針,）,）,3.3.4,逆,逆,轉(zhuǎn),轉(zhuǎn),錄,錄,酶,酶,是,一,一,種,種,有,有,效,效,的,的,轉(zhuǎn),轉(zhuǎn),錄,錄RNA,成,成,為,為DNA,的,的,酶,酶,，,，,又,又,稱,稱RNA,依,依,賴,賴,的,的DNA,聚,聚,合,合,酶,酶,，,，,其,其,產(chǎn),產(chǎn),物,物DNA,稱,稱cDNA,，,，,即,即,互,互,補,補DNA,。,。,1.,逆,逆,轉(zhuǎn),轉(zhuǎn),錄,錄,酶,酶,也,也,是,是,一,一,個,個,多,多,功,功,能,能,酶,酶,：,：,(1)RNA,依,依,賴,賴,的,的DNA,聚,聚,合,合,酶,酶,以RNA,鏈,鏈,為,為,模,模,板,板,，,，,以,以,帶,帶,有,有3,-OH,末,末,端,端,的,的DNA,片,片,段,段,為,為,引,引,物,物,，,，,沿,沿5,3,方,方,向,向,合,合,成,成DNA,鏈,鏈,。,。,幾,乎,乎,所,所,有,有,真,真,核,核,生,生,物,物,的,的mRNA,分,分,子,子3,末,末,端,端,都,都,有,有,一,一,段,段PolyA,，,，,故,故,加,加,入,入,寡,寡,聚,聚dT,后,后,，,，mRNA,就,就,可,可,以,以,成,成,為,為,逆,逆,轉(zhuǎn),轉(zhuǎn),錄,錄,酶,酶,很,很,好,好,的,的,模,模,板,板,，,，,由,由,此,此,可,可,合,合,成,成cDNA,。,。,(2)DNA,依,依,賴,賴,的,的DNA,聚,聚,合,合,酶,酶,以ssDNA,為,為,模,模,板,板,，,，,以,以,帶,帶,有,有3,-OH,末,末,端,端,的,的DNA,片,片,段,段,為,為,引,引,物,物,，,，,沿,沿5,3,方,方,向,向,合,合,成,成DNA,鏈,鏈,。,。,可,在,在,新,新,合,合,成,成,的,的DNA,鏈,鏈,上,上,合,合,成,成,另,另,一,一,條,條,互,互,補,補DNA,。,。,(3),外,外,切,切RNA,酶,酶,活,活,性,性,底,物,物,是,是RNA-DNA,雜,雜,交,交,分,分,子,子,中,中,的,的RNA,鏈,鏈,，,，,其,其,水,水,解,解,方,方,向,向,有,有,兩,兩,種,種,：,：,*,從,從RNA,鏈,鏈5,末,末,端,端,外,外,切,切,：,：,稱,稱5,3,外,外,切,切RNA,酶,酶,*,從,從RNA,鏈,鏈3,末,末,端,端,外,外,切,切,：,：,稱,稱3,5,外,外,切,切RNA,酶,酶,2.,逆,逆,轉(zhuǎn),轉(zhuǎn),錄,錄,酶,酶,在,在,基,基,因,因,工,工,程,程,中,中,的,的,應,應,用,用,：,：,主,要,要,用,用,途,途,是,是,轉(zhuǎn),轉(zhuǎn),錄,錄,真,真,核,核,生,生,物,物,的,的mRNA,成,成,為,為cDNA,，,，,從,從,而,而,制,制,備,備,基,基,因,因,片,片,段,段,。,。,3.,商,商,品,品,化,化,的,的,逆,逆,轉(zhuǎn),轉(zhuǎn),錄,錄,酶,酶,有,有,兩,兩,種,種,：,：,(1),禽,禽,成,成,髓,髓,細,細,胞,胞,瘤,瘤,病,病,毒,毒,（,（AMV,）,）,逆,逆,轉(zhuǎn),轉(zhuǎn),錄,錄,酶,酶,(2)Moloney,鼠,鼠,白,白,血,血,病,病,病,病,毒,毒,（,（Mo-MLV,）,）,逆,逆,轉(zhuǎn),轉(zhuǎn),錄,錄,酶,酶,AMV,逆,逆轉(zhuǎn)錄,酶,酶雖能,更,更有效,地,地拷貝,復,復雜的mRNA，但,它,它有很,強,強的外,切,切RNA酶活,性,性。而Mo-MLV,逆,逆轉(zhuǎn)錄,酶,酶的外,切,切RNA酶活,性,性較弱,，,，更有,利,利于制,備,備全長,的,的cDNA。,兩種逆,轉(zhuǎn),轉(zhuǎn)錄酶,均,均無3,5外,切,切DNA酶活,性,性，故,不,不具備,校,校對功,能,能，在,高,高濃度dNTP和Mn,2+,存在下,，,，容易,出,出現(xiàn)核,苷,苷酸錯,誤,誤摻入,。,。,3.4DNA和RNA的,修,修飾酶,3.4.1,核,核酸酶SI,1.,作,作用,特,特點：,此酶是,從,從米曲,霉,霉（,Aspergillusoryzae,）中提,取,取的，,可,可降解ssDNA或ssRNA，,又,又稱單,鏈,鏈特異,性,性酶，,其,其降解,產(chǎn),產(chǎn)物是5-,磷,磷酸末,端,端的單,或,或寡核,苷,苷酸片,段,段。,核酸