共焦顯微鏡剖析

單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,*,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),樣品要求,原理,功能,在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)及應(yīng)用,The techniques and application of Confocal Laser Scanning Microscopy,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),人眼區(qū)分率：0.2mm,光學(xué)顯微鏡區(qū)分率：0.25mm,電子顯微鏡區(qū)分率：0.2nm,共焦顯微鏡區(qū)分率：0.18mm,二、原理,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),原理小結(jié):,Confocal 利用放置在光源后的照明針孔和放置在檢測器前的探測針孔實現(xiàn)點照明和點探測，來自光源的光通過照明針孔放射出的光聚焦在樣品焦平面的某個點上，該點所放射的熒光成像在探測針孔上，該點以外的任何放射光均被探測針孔阻擋。照明針孔與探測針孔對被照射點或被探測點來說是共軛的，因此被探測點即共焦點，被探測點所在的平面即共焦平面。計算機以像點的方式將被探測點顯示在計算機屏幕上，為了產(chǎn)生一幅完整的圖像，由光路中的掃描系統(tǒng)在樣品焦平面上掃描，從而產(chǎn)生一幅完整的共焦圖像。只要載物臺沿著Z軸上下移動，將樣品新的一個層面移動到共焦平面上，樣品的新層面又成像在顯示器上，隨著Z軸的不斷移動，就可得到樣品不同層面連續(xù)的光切圖像。,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)分,1.抑制圖像的模糊，獲得清晰的圖像,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)分,2.具有更高的軸向區(qū)分率，并可獵取連續(xù)光學(xué)切片,conventional,confocal,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)分,3.增加側(cè)向區(qū)分率,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),共焦顯微鏡與傳統(tǒng)顯微鏡的區(qū)分,4.由于點對點掃描去除了雜散光的影響,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),三.激光掃描共焦顯微鏡的設(shè)計特點:,1.點照明,2.具有照明pinhole和探測pinhole,3.照明pinhole和探測pinhole共軛(共焦),共焦點即被探測點，被探測點所在的平面為共焦平面,4.具有掃描系統(tǒng) 逐點掃描成像,5.具有多個四個 熒光通道，可同時探測多個被標記物,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),技術(shù)指標Leica TCS SP2):,1.xy區(qū)分率比傳統(tǒng)顯微鏡小1.4x,傳統(tǒng)顯微鏡:Rxy=0.61/NA 0.25 m),Confocal:Rxy=0.4/NA0.18 m),2.樣品的最大厚度:,取決于:物鏡的NA、物鏡的工作距離,激光的穿透力、樣品的透亮度,Z軸的最大移動范圍(166m、Z-wide),3.樣品的最小光切厚度:(載物臺最小移動距離為40nm,取決于:物鏡的NA、針孔大小,Z軸的最小移動步距:40nm,Z軸的區(qū)分率:0.35 m,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),4.激光器,Ar激光器:458nm,476nm,488nm,514nm,GreNe:543nm;HeNe:633nm,Ar激光器(UV):361nm,激光器的特點:,1)方向性好:激光根本延直線傳播,2)單色性好:=10-8nm,3)高亮度:激光方向性好,其在空間上的能量分布是高度,集中的。,4)偏振性:激光為平面偏振光,光纖耦合,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),5.四個熒光通道,一個透射光通道,即除了可同時采集多標記熒光圖像外,還可以同時采集透射光圖像,但透射光,圖像為,非共焦圖像,。,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù),6.掃描速度:slow 220lines/s 512512 2-3秒,slow2 440lines/s2：雙向掃描,medium 450lines/s 512512 1.7秒,medium2 900lines/s,fast 1000lines/s 512512 0.7秒,128128 0.2秒,fast2 2023lines/s,7.掃描密度:,6464,128128,512512,10241024,20482048,激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用,The application of Confocal Laser Scanning Microscopy,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,功能.,1.多熒光標記樣品的高清晰度、高區(qū)分率圖像采集,2.無損傷、連續(xù)光學(xué)切片，顯微“CT”,3.真正的三維重組,4.假三維圖的顯示,5.可沿Z軸xy平面和Y軸xz平面方向進展光切,6.定量分析,7.時間序列掃描:xyt、xyzt 和 xt 掃描,8.圖像處理,9.旋轉(zhuǎn)掃描,10.感興趣區(qū)域掃描,11.光譜掃描,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,應(yīng)用,定位、定量,三維重組,動態(tài)測量,活細胞或組織內(nèi)游離Ca,2+,分布和濃度的變化,測量(Mg,2+,、Zn,+,、Na,+,、K,+,),自由基的檢測,藥物進入細胞的動態(tài)過程、定位分布及定量,蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,活細胞內(nèi)H+濃度 pH值的測量,線粒體膜電位的測量,熒光漂白恢復(fù)FRAP的測量,籠鎖解籠鎖的測量,熒光能量共振轉(zhuǎn)移FRET的測量,其他應(yīng)用,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,一、定位、定量,免疫熒光標記單標、雙標或三 標的定位、定量：如：細胞膜受體或抗原的分布，,微絲、微管的分布、兩種或三種蛋 白的共存與共定位、蛋白與細胞器的 共定位、核轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)位和干細胞的 增值、分化,細胞凋亡:AnnexinV-fitc+PI,末端原位雜交-fitc+PI,熒光原位雜交：染色體基因定位,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,定位、定量爭論中常用熒光探針,1.Amine-Reactive Probes,與抗體耦聯(lián)、與配體耦聯(lián)、與肽耦聯(lián)、與人工合成的寡聚核苷酸耦聯(lián)的探針，可用于免疫組化、熒光原位雜交、受體標記等,Green Red Fura-red,FITC 494/518 TRITC 544/572 Cy5 650/690,(異硫氰基熒光素)(四甲基異硫氰基羅丹明),Alexa Fluor 488 488/530 PE 565/578,(藻紅蛋白),Texas Red 595/615,(德州紅),Cy3 558/568,BODIPY FL 503/512 BODIPY TMR 543/569 BODIPY TR,592/618,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,1)細胞外表抗原、胞內(nèi)某種蛋白,免役熒光標記：與抗體耦聯(lián),直標:一抗+熒光探針,間標:二抗+熒光探針,如:微管蛋白tublin(抗 tublin抗體+熒光探針),肌動蛋白actin(Palloidine+熒光探針),2)細胞膜外表受體,配體+熒光探針,如:nAchR、mAchR、多巴胺受體(D1,D2),標記 Gm1:霍亂毒素受體,霍亂毒素+FITC,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,2.標記細胞器熒光探針,1)線粒體 Mitochondria,Rodamin 123 505/534，可染活細胞，陽離子,可檢,測線粒體膜電位,且在多數(shù)細胞中停留,時間短,JC1 線粒體膜電位低時為單體 490/527 發(fā)綠光,線粒體膜電位高時為多聚體 490/590 發(fā)紅光,可標記活細胞線粒體，且為檢測線粒體膜電位最,佳探針,Mitotracker Green FM 490/516,染活細胞或固定細胞,穩(wěn)定不漏出,Mitotracker Orange CMTMRos 551/576,(氧化型),Mitotracker Orange 復(fù)原型,只能染活細胞,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,2)溶酶體 Lysosome,中性紅 541/640:微偏堿性,可標記溶酶體等酸官,為非特異性,AO:,LysoTracker Green DND-26 504/511,染活細胞,LysoTracker Blue,LysoTracker Red,3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) Endoplasmic Reticulum,DiOC6 484/500:非特異性,較高濃度標記內(nèi)質(zhì)網(wǎng),較低濃度標記線粒體,4)高爾基體 Golgi apparatus,NBD C6-ceramie 466/536,可染活或死細胞,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,細胞器的單克隆抗體,5)細胞核,PI propidium iodide 536/617 DNA/RNA 死細胞,碘化丙啶,EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死細胞,Hochest 33342,352/,461 DNA A-T,活細胞,Hochest 33258,352/,461 DNA A-T,活細胞,DAPI,358,/461 DNA A-T 半通透細胞,Chromomycin A3 450/470 DNA G-C,AO 500/526 DNA 活細胞,560/650 RNA,TOTO-1 514/533 DNA 死細胞,SYTO1116 2024 488/520 活細胞,SYTO1116 2024 521/556,活細胞,SYTO 17 621/634 活細胞,3.GFP 綠色熒光蛋白,GFP的的覺察：60年月，Shimomura等首先從水母中分別出一種水母發(fā)光蛋白(aequoren)，該蛋白與鈣和腸腔素結(jié)合后可產(chǎn)生藍色熒光。然而水母整體幾提取的顆粒都呈綠色，后經(jīng)證明在水母體內(nèi)還存在另外一種發(fā)光蛋白即綠色熒光蛋白 GFP,后經(jīng)爭論說明，在水母體內(nèi)Ca2+和腸腔素與水母發(fā)光蛋白結(jié)合后，水母發(fā)光蛋白產(chǎn)生藍色熒光，GFP在藍光的激發(fā)下，產(chǎn)生綠色熒光。,將外源基因與GFP DNA 相連,GFP可作為外源基因的報告基因?qū)崟r監(jiān)測外源基因的表達.,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,GFP主要應(yīng)用:,對活細胞中的蛋白質(zhì)進展準確定位及動態(tài)觀看,可實時原位跟蹤特定蛋白在細胞生長、分裂、分化過程中或外界刺激因子的作用下的時空表達,如某種轉(zhuǎn)錄因子的核轉(zhuǎn)位、蛋白激酶C的膜轉(zhuǎn)位等。,GFP基因與分泌蛋白基因連接后轉(zhuǎn)染細胞,可動態(tài)觀看 該分泌蛋白分泌到細胞外的過程,GFP基因與定位于某一細胞器特殊蛋白基因相連,就能顯 示活細胞中細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細胞器的構(gòu)造及病理過程,可用于觀看分子的運動FRAP,蛋白之間的相互作用FRET,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,三.動態(tài)測量,Physiology:細胞內(nèi)離子動態(tài)變化測量,1).游離Ca2+測量,檢測游離Ca2+變化熒光探針的原理：這類探針多為Ca2+螯合劑，不與Ca2+結(jié)合時不發(fā)熒光，通常也不能進入細胞膜，只有與乙酰甲酯AM相連方可進入細胞內(nèi)，被細胞內(nèi)酯酶水解后并與胞內(nèi)游離鈣結(jié)合后發(fā)出熒光。Kd值為Ca2+解離常數(shù)，說明檢測Ca2+濃度的范圍:0.1xKd-10 xkd,Kd和很多因素有關(guān)，如pH、Mg2+、與蛋白的結(jié)合、溫度等。細胞內(nèi)生理Ca2+濃度值(10-100n M)，細胞內(nèi)Ca2+超載濃度值根底Ca2+濃度的10倍左右,熒光探針 激發(fā)波長放射波長 Kd,FLuo3-AM,K+,dextran 506nm 525nm 390nM,Fluo4 506nm 525nm,Calcium Green-1 507nm 530nm 190nM,Calcium Green-2 507nm 535nm 550nM,Fura red 420/480nm 637nm 140nM,Oregon Green 488 494nm520nm 20,000nM,Calcium Crimson 583nm 602nm 328nM,Indo-1 356nm 405/458nm 230nM,Fura-2 340/380 476nm 145nM,激光掃描共焦顯微鏡應(yīng)用,程序化測量：用timelapse中的編程按鈕可進展不同時間序列的掃描測 量。,F/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG),Ca2+濃度確定測量,1單波長公式法,Fluo3:530nm Kd=450nM,Ca2+I=Kd(F-Fmin)/(Fmax-F),Fmin:細胞內(nèi)無鈣時的熒光強度(MnCl2),Fmax：細胞內(nèi)鈣飽和時的熒光強度(A23187),測量時切記細胞內(nèi)靜息Ca2+濃度的相對熒光強度值不能太低F值不低于40,激