雪花梨中黃酮的提取工藝分析研究 生物技術(shù)專業(yè)

摘 要新鮮的梨中含有較多糖類物質(zhì)和多種維生素，其中B族維生素最為豐富。具有降血壓、清熱利濕的功效，對于心臟病、頭暈?zāi)垦６Q，都有很好的治療效果。梨中含有的天門冬素，對保護腎臟有益。含有的維生素B1、維生素B2對調(diào)解神經(jīng)系統(tǒng)、增加心臟活力、減輕疲勞有一定作用。梨子還能提供鉀和纖維質(zhì)。梨所含的配糖體及鞣酸等成分，能祛痰止咳，對咽喉有養(yǎng)護作用。其中糖類物質(zhì)和多種維生素，易被人體吸收，增進食欲，對肝臟具有保護作用。梨中含有的豐富的B族維生素，能保護心臟，減輕疲勞，增強心肌活力，降低血壓。而且梨中的果膠含量很高，有助于消化、通利大便。食梨還能防止動脈粥樣硬化，抑制致癌物質(zhì)亞硝胺的形成，從而防癌抗癌。截止到2007年，我國每年的梨產(chǎn)量已經(jīng)超過了7000×104t,且梨的種植面積和總產(chǎn)量也已經(jīng)躍居至世界第一。然而，隨著經(jīng)濟的迅速發(fā)展，越來越多的梨被加工成各種各樣的梨產(chǎn)品，不僅能保存梨的風(fēng)味，還能使梨的價值得到最大化利用。但是在加工過程產(chǎn)生的大量梨皮, 多數(shù)情況下這些梨皮被作為廢物丟棄。為了使梨得到最大化利用，從而對梨皮進行黃酮類物質(zhì)提取, 同時還解決了丟棄梨皮梨渣造成的環(huán)境污染。本實驗研究課題采用的是超聲法輔助提取梨皮中的黃酮類物質(zhì)，提取的溶劑為不同濃度的乙醇溶液，研究和優(yōu)化提取工藝，并確定其抑菌效果。采用單因素法確定因素范圍，響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件,測定黃酮類物質(zhì)的含量,最終確定最佳提取工藝為： 乙醇濃度為40%， 提取時間為56.62min， 料液比為115， 超聲溫度為60。根據(jù)優(yōu)化的工藝條件提取得到的黃酮提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的有明顯的抑菌效果。關(guān)鍵詞：梨；超聲波；響應(yīng)面法；黃酮；抑菌目 錄1材料與方法- 2 -1.1材料與儀器- 2 -1.2 實驗方法- 2 -1.3 方案設(shè)計- 3 -2 結(jié)果與分析- 4 -2.1 單因素實驗結(jié)果與分析- 4 -2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析- 6 -2.3 抑菌實驗結(jié)果- 11 -結(jié) 論- 11 -主要參考文獻- 13 -致 謝- 15 -引 論縱觀國內(nèi)外對植物中黃酮提取的研究現(xiàn)狀，對黃酮提取主要有以下兩個方面的不同。一是提取的溶劑不同。黃酮提取的溶劑一般有乙醇、乙醚、石油醚、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、苯等。依據(jù)極性相似相溶的原理，將黃酮提取出來。其中乙醚、石油醚 、乙酸乙酯和苯一類的親脂性溶劑，極性較小，介電常數(shù)小，且價格高、易燃、有毒、穿透性差、對設(shè)備要求高。而乙醇、甲醇、丙酮一類的親水性溶劑，極性較大，介電常數(shù)大，應(yīng)用范圍廣、易過濾、不霉變、易濃縮回收。其中乙醇應(yīng)用的最廣泛、最安全。二是提取方法不同。黃酮提取的方法主要有如下幾種：（1）熔劑法、熱水提取法、堿性水或堿性稀醇提取法、有機溶劑提取法；（2） 微波提取法；（3）超聲波提取法；（4） 超臨界流體萃取法；（5） 酶法提取；（6） 雙水相提取法；（7）半仿生提取法；（8） 膜分離法；（9）熱壓流體萃取法；（10） 高壓液相提取法；而用超聲波提取法提取黃酮類物質(zhì)，是目前比較新的方法。原理是利用超聲波在液體中的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外，還利用其次效應(yīng)，如機械振動、擴散、擊碎等，使其加速被提取成分的擴散、釋放。超聲波提取法具有設(shè)備簡單，操作方便，提取時間短，產(chǎn)率高，無需加熱，同時有利于保護熱不穩(wěn)定成分，省時，節(jié)能，提取率高的優(yōu)點。依據(jù)查閱的文獻可知，梨中含有大量的黃酮，而梨皮在加工過程中往往被丟棄，所以梨皮中的黃酮也就被浪費了。本選題主要研究超聲波法提取梨皮中的黃酮，研究對象為市售新鮮梨的梨皮，經(jīng)過清洗、烘干等處理后，研磨成粉狀，進行實驗。本實驗選取超聲波提取法用乙醇從梨子皮中提取黃酮物質(zhì)，研究乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度四個因素對提取效果的影響，確定最佳工藝參數(shù)，再運用響應(yīng)面法優(yōu)化工藝參數(shù)， 并對提取的黃酮類物質(zhì)進行抑菌實驗研究。1 材料與方法1.1 材料與儀器1.1.1 實驗材料梨子皮：新鮮梨削皮后，取梨皮，處理后作為實驗原料1.1.2 實驗試劑蘆丁、無水乙醇、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁（均為分析純） ；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉；大腸桿菌，金黃色葡萄球菌。1.1.3 主要儀器和設(shè)備JY-1000A高速多功能粉碎機（浙江省永康市象珠松青五金廠）；AR2140分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；GX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任有限公司）；V-1100D可見分光光度計（上海美普達儀器有限公司）；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；LGJ-10D普通型冷凍干燥機等。1.2 實驗方法本實驗研究課題采用的是超聲法輔助提取梨皮中的黃酮類物質(zhì)，提取的溶劑為不同濃度的乙醇溶液，研究和優(yōu)化提取工藝，并確定其抑菌效果。采用單因素法確定因素范圍，響應(yīng)面法優(yōu)化工藝條件, 并對提取的黃酮類物質(zhì)進行抑菌實驗研究。1.2.1 樣品的準(zhǔn)備新鮮梨子皮經(jīng)蒸餾水洗凈后，切成小塊放入電熱鼓風(fēng)干燥箱 60-65中烘干8h。取出后放在粉碎機中粉碎成末過 40目篩，然后再放入烘箱中烘干1h，冷卻后干燥儲存。1.2.2 梨皮黃酮類物質(zhì)的提取工藝流程梨 子 皮 渣 清 洗 60烘干粉碎過篩超聲波輔助提取過濾濾液離心定容（上清液）吸光度測定1.2.3 黃酮含量的測定及黃酮提取率的計算本實驗采用亞硝酸鈉- 硝酸鋁分光光度法對提取液黃酮含量進行測定。（1）蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作稱取干燥恒重的蘆丁 0.500g，用 60%乙醇定容配制成 1.5mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。 吸取 0mL、0.1mL、 0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL 于比色管中，分別加60%的乙醇至5mL，加 5% 亞硝酸鈉 0.3mL，放置 6min，加 10%硝酸鋁 0.3mL， 混勻放置 6min，加 4% NaOH 2mL，定容至 10mL，靜置 20min，以相應(yīng)試劑為空白，在最大吸收波長 510nm 處測吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)，濃度 為橫坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=8.3985x+0.1564,R²=0.9589。（2）樣品中總黃酮的測定取 1mL 提取液于 10mL 比色管中，加 60%乙醇 至 5mL，按（1）操作，將測得的吸光值代入回歸方程，通過下面公式計算樣品中黃酮類物質(zhì)的含量。黃酮類物質(zhì)的得率/% =c×v×v1000×w×v×100%式中：c 由回歸方程得到樣品中黃酮類物質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg/mL；樣品液定容總體積，mL； 顯色反應(yīng)定容體積，mL； 測定取樣體積，mL；w稱取的梨子皮樣品質(zhì)量，g。1.3 方案設(shè)計1.3.1超聲輔助提取黃酮類物質(zhì)的單因素實驗選擇乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度4 個因素，分別考察了各因素對梨皮黃酮提取率影響，并確定各因素的最適范圍。1.3.2超聲輔助提取黃酮類物質(zhì)的響應(yīng)面實驗運用Box-Behnken 試驗設(shè)計，結(jié)合單因素實驗結(jié)果，對乙醇濃度、料液比、超聲時間、超神溫度4個因素，分別以A、B、C 和D 表示，每個實驗黃酮類物質(zhì)的得率為響應(yīng)值（Y），確定最優(yōu)的提取工藝。實驗因素及水平見表1.1。表1.1 響應(yīng)面實驗的因素水平表因素水平-101A乙醇濃度（%）405060B料液比（g/mL）1:101:151:20C超聲時間（min）506070D超聲溫度（）5055601.3.3 黃酮提取液的抑菌實驗（1）培養(yǎng)基的配制稱取等量2份牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基與三角瓶中，分別加入100mL無菌水，加熱溶解，滅菌備用。（2） 菌懸液的制備依據(jù)實驗文獻的可知在600 nm 處菌懸液OD 值為0.1 即為菌體濃度達到1×106 - 1×107個/mL，相當(dāng)于0.5個麥?zhǔn)媳葷岫?。參照此?shù)據(jù)進行菌懸液濃度的確定。挑取適量活化好的菌種于裝有生理鹽水的三角瓶中，即得到菌懸液。（3）抑菌試驗將滅菌后的培養(yǎng)基置于超凈工作臺中冷卻到50左右，將100mL培養(yǎng)基平均加入到6個培養(yǎng)皿中制成培養(yǎng)基平板。并給培養(yǎng)基平板編號，冷卻后分別加入各菌懸液0.1 mL，用涂布棒涂布均勻。濾紙片事先用打孔器打成小圓片，滅菌后放置在超凈工作臺中備用。用鑷子夾取3片等距離放在平板上，用移液槍吸取稀釋后不同濃度的黃酮提取液滴加到濾紙片上，將生理鹽水作為陰性對照。平行實驗兩組，置于37 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后觀察統(tǒng)計抑菌圈大小，并評價其抑菌效果。2 結(jié)果與分析2.1 單因素實驗結(jié)果與分析2.1.1 乙醇濃度對黃酮提取效果的影響料液比1:15，超聲時間50min，超聲溫度60，不同乙醇濃度對黃酮提取效果的影響結(jié)果見圖2.1。圖2.1 乙醇濃度對黃酮提取效果的影響隨著乙醇濃度的增大，黃酮的提取率先增大后減小。低濃度乙醇，提取不充分，而且水溶性雜質(zhì)易溶出，給后續(xù)的分離純化帶來困難。高濃度乙醇，提取過程中揮發(fā)嚴(yán)重，并且醇溶性雜質(zhì)也增多，影響黃酮類化合物的得率。2.1.2 料液比對黃酮提取效果的影響乙醇濃度60%，超聲時間50min，超聲溫度60，不同料液比對黃酮提取效果的影響見圖2.2。圖2.2 料液比對黃酮提取效果的影響隨著溶劑量的增大，黃酮類物質(zhì)的溶出量會增大，但隨溶劑量達到一定值后，一方面由于黃酮的溶出量有限，溶劑用量大造成浪費；另一方面大量的溶劑會導(dǎo)致多糖等雜質(zhì)的大量溶出，有多糖等雜質(zhì)對黃酮的吸附作用，會影響提取結(jié)果。因此從提取效果、減少溶劑用量和降低濃縮負(fù)荷能耗等方面綜合考慮，溶劑用量也不宜過大。2.1.3 超聲時間對黃酮提取效果的影響乙醇濃度60%，料液比1:15，超聲溫度60，不同超聲時間對黃酮提取效果的影響見圖2.3。圖2.3 超聲時間對黃酮提取效果的影響在提取時間上，并非提取時間越長越好，如圖3 所示，在60min 總黃酮得率較高。可能是因為超聲波提取時間過長，超聲產(chǎn)生的熱量也較多，導(dǎo)致溶液溫度上升， 且由于黃酮類物質(zhì)不穩(wěn)定易氧化，長時間提取可能造成部分黃酮類物質(zhì)被氧化，提取溶劑揮發(fā)，提取物與氧氣接觸導(dǎo)致總黃酮得率下降。也可能是因為隨著提取時間的加長，溶出的雜質(zhì)也會增多。2.1.4 超聲溫度對黃酮提取效果的影響乙醇濃度60%，料液比1:15，超聲時間60min，不同超聲溫度對黃酮提取效果的影響見圖2.4。圖 2.4 超聲溫度對黃酮提取效果的影響在提取時間上，并非提取時間越長越好，如圖3 所示，在60min 總黃酮得率較高?？赡苁且驗槌暡ㄌ崛r間過長，超聲產(chǎn)生的熱量也較多，導(dǎo)致溶液溫度上升， 且由于黃酮類物質(zhì)不穩(wěn)定易氧化，長時間提取可能造成部分黃酮類物質(zhì)被氧化，提取溶劑揮發(fā)，提取物與氧氣接觸導(dǎo)致總黃酮得率下降。也可能是因為隨著提取時間的加長，溶出的雜質(zhì)也會增多。2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析2.2.1 模型的建立與顯著性檢驗利用軟件Design Expert 8.0.6 中的Box-Behnken 模式對乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度設(shè)計響應(yīng)面試驗，依據(jù)表1.1中的因素與水平值，每個試驗組均進行平行試驗以減少操作誤差，其試驗結(jié)果見表2。表 2.1 響應(yīng)面法的實驗設(shè)計與結(jié)果試驗號ABCD黃酮提取率（%）1001-12.21210-101.96310101.25400001.78501010.556100-10.36711000.928-10-102.69-1-1001.55100-1011.3311010-10.041200001.881300002.09140-10-11.2215-10102.6316-11002.37170-1101.561810010.68190-1-102.632001-101.322100002.332200-1-11.3023-10012.712401100.452500-111.30261-1001.402700002.1328-100-12.652900110.93利用軟件Design Expert 8.0.6 軟件對表2.1 中的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到菠蘿皮黃酮化合物得率的預(yù)測值（Y）對編碼自變量超聲功率（A）、超聲時間（B）、乙醇濃度（C）和料液比（D）的回歸方程:黃酮提取率=2.0420.662A0.337B0.023C0.173D0.325AB+0.065AC0.185AD+0.1BC+0.05BD0.32CD+0.117A²0.6B²0.608C²0.0002D²對該回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表2.2表 2.2 響應(yīng)面法實驗結(jié)果的方差分析方差來源平方和自由度均方F值P值顯著性模型12.81140.923.470.0133*A5.2515.2519.900.0005*B1.3611.365.150.0395*C6.533×10-316.533×10-30.0250.8772D03610.361.370.2620AB0.4210.421.600.2265AC0.01710.0170.0640.8039AD0.1410.140.520.4833BC0.04010.0400.150.7029BD0.01010.0100.0380.8485CD0.4110.411.550.2333A²0.08910.0890.340.5701B²2.3412.348.850.0100*C²2.4012.409.070.0093*D²1.802×10-711.802×10-76.826×10-70.9994殘差3.70140.26失擬項3.51100.357.470.0338*純誤差0.1940.047總離差16.5128對表2.2的數(shù)據(jù)分析可知：該回歸模型顯著。失擬項P=3.51 0.05， 不顯著，說明該回歸模型與實驗數(shù)據(jù)的擬合度較高，實驗誤差小，可用該模型分析和預(yù)測超聲波輔助提取菠蘿皮中黃酮類物質(zhì)的工藝結(jié)果。4個因素中A的影響差異極顯著，B的影響差異顯著，C、D、AB、AC、AD、BC、BD、CD的影響差異不顯著。2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化通過Design-Expert 軟件對各因素之間的交互作用進行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面曲線圖。圖2.5圖2.10 分別顯示6組以黃酮提取量為響應(yīng)值的趨勢圖。從其等高線圖可直觀反映出2 個變量間交互作用的顯著程度，其中圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示兩因素交互作用顯著。圖 2.5 乙醇濃度和料液比對黃酮提取率的等高線圖和響應(yīng)面圖圖 2.6 乙醇濃度和超聲時間對黃酮提取率的等高線圖和響應(yīng)面圖圖 2.7 乙醇濃度和超聲溫度對黃酮提取率的等高線圖和響應(yīng)面圖圖 2.8 料液比和超聲時間對黃酮提取率的等高線圖和響應(yīng)面圖圖 2.9 料液比和超聲溫度對黃酮提取率的等高線圖和響應(yīng)面圖圖 2.10 超聲時間和超聲溫度對黃酮提取率的等高線圖和響應(yīng)面圖根據(jù)響應(yīng)面法試驗結(jié)果及其回歸方程模型分析可知，超聲輔助提取菠蘿皮黃酮類物質(zhì)的優(yōu)化工藝條件為乙醇濃度40%，料液比1:15；超聲時間56.62min；超聲溫度60攝氏度。預(yù)測黃酮得率為2.9019%?？紤]到實際操作的便利，將優(yōu)化工藝中的條件修正為：乙醇濃度40%，料液比1:15；超聲時間57min；超聲溫度60攝氏度，進行3 次平行重復(fù)驗證實驗，得出此修正條件下黃酮類物質(zhì)的平均提取率為2.9537%，該實驗值與模型方程的預(yù)測值僅相差0.052%，表明經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化的提取工藝組合條件較為準(zhǔn)確，利用超聲輔助提取菠蘿皮渣中黃酮類物質(zhì)具有一定的實際意義。2.3 抑菌實驗結(jié)果將黃酮提取液稀釋為不同濃度。觀察濾紙片周圍是否出現(xiàn)透明圈，結(jié)果見表2.1。表 2.1抑菌作用結(jié)果稀釋倍數(shù)結(jié)果大腸桿菌金黃色葡萄菌1-1/2-+1/4+1/8+注 ：-表示有透明抑菌圈；+表示幾乎沒有抑菌圈；+表示細(xì)菌大量生長。由表2.1可知，當(dāng)黃酮提取液稀釋為1/2時，大腸桿菌周圍有抑菌圈，而金黃色葡萄球菌周圍無抑菌圈，當(dāng)黃酮提取液濃度更低時，兩種菌均無抑菌圈?？梢钥闯鳇S酮提取液對兩種菌有著不同程度的抑菌效果。 結(jié) 論結(jié)合單因素實驗和響應(yīng)面實驗的結(jié)果，確定乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度均對黃酮提取均有顯著影響，影響順序依次為：料液比>乙醇濃度>超聲功率>超聲時間，運用Design Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行多元回歸方程擬合及方差統(tǒng)計分析，得到最佳提取工藝條件為：超聲功率485W，超聲時間26min，料液比為1 51，乙醇濃度為44%，黃酮的提取率為2.7075%，高于相關(guān)文獻報道。此外，本試驗僅對菠蘿皮黃酮類化合物的提取進行研究，黃酮的純化、精制及其成分分析還有待于進一步研究。主要參考文獻1 郭海麗.梨皮化學(xué)成分的LC-MS和NMR研究D.華中師范大學(xué)碩士學(xué)位論文.2014.2 劉憐文，張幸濤，劉倩. 超聲波輔助提取菠蘿皮中黃酮及其抑菌作用J. 食品與發(fā)酵科技，2014，50（1）：56-59.3 杭瑜瑜.勵建榮.裴志勝.劉志燕.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取菠蘿皮中黃酮J.中國食品添加劑，2015，5:142-149.4 胡銀川, 李明元, 邱一雯, 章書凡.菠蘿皮總黃酮的提取工藝優(yōu)化J.西華大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2010,29（3）：108-110.5 張文華，王維民，諶素華.不同方法對菠蘿皮類黃酮J.食品科技，2011，36（11）：201-204.6 趙悅，孫慶元，孫琦.橘黃酮的提取及其抑菌特性J.化工進展，2016,35（8）：2528-2532.7 楊小慧，石光波，拜曉彬，趙晨煊，李博生.文冠果落果黃酮及抑菌性研究J.食品科學(xué)，2017.8 林建原，季麗紅.響應(yīng)面優(yōu)化銀杏葉中黃酮的提取工藝J.中國食品學(xué)報，2013,13（2）：83-909 王宗成，龍燕萍，彭延波，盤雪，趙石喬，周勇，羅小芳.響應(yīng)面優(yōu)化油茶葉黃酮提取工藝及抑菌活性研究J.中國油脂，2017，42（4）：123-130.10 Sing Pei Tan1, Sophie E. 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