用免疫親和層析柱作為預(yù)處理通過LC-MSMS法檢測農(nóng)水產(chǎn)品中氯霉素的殘留分析研究 生物技術(shù)專業(yè)

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1、 目錄摘要3Abstract4第一章 緒論61.1 引言61.2 新型樣品前處理技術(shù)的評價及發(fā)展61.2.1 樣品前處理方法的評價61.2.2 樣品預(yù)處理方式及適用條件61.2.3 常用預(yù)處理方法：固相萃取技術(shù)71.2.4 樣品預(yù)處理技術(shù)的發(fā)展81.3 免疫分析81.3.1 抗原91.3.2 抗體101.3.3 抗原抗體反應(yīng)101.4 免疫親和層析柱（IAC）111.4.1 簡述及現(xiàn)狀111.4.2 IAC 的原理111.4.3 IAC的優(yōu)勢12第二章 氯霉素單組分免疫親和色譜法的建立132.1 氯霉素檢測方法的現(xiàn)狀132.2 氯霉素132.2.1 氯霉素分類132.2.2氯霉素檢測方法142

2、.3 本課題的研究意義及目的142.4 實驗材料152.4.1 實驗試劑152.4.2 溶液配制152.4.3 實驗儀器和設(shè)備162.5 實驗部分172.5.1操作條件172.5.2 抗體的獲取與純化182.5.3 抗體蛋白含量的測定192.5.4抗體純度測定202.5.5 氯霉素免疫親和柱的制備202.5.6 氯霉素免疫親和柱的表征212.7 結(jié)果與討論232.7.1 氯霉素抗體濃度的測定232.7.2 氯霉素抗體純度的測定242.7.3 IAC交聯(lián)程度測定242.7.4 氯霉素免疫親和柱特性表征252.7.5 對比SPE柱凈化結(jié)果討論26總結(jié)27參考文獻28致謝30摘要 食品安全引人重視，

3、國計民生時刻關(guān)注。食品安全無疑是小民生里滲透著的大科學(xué)。如何使民眾的身體健康與生命安全的得到有效保障？嚴峻的形勢亟待我們建立一種有效的針對食品中存在的有毒有害物質(zhì)進行提取，純化并與檢測儀器結(jié)合使用的高效分析檢測方法。這種預(yù)處理方法還應(yīng)該具備簡單、便捷、高效和可靠的特點。氯霉素作為一種對人體健康有害的，常被濫用于農(nóng)水產(chǎn)品的抗生素，有必要施行對它的便捷的預(yù)處理，以便后續(xù)檢測。本實驗旨在建立一種單組分的氯霉素的免疫親和色譜法，用于萃取分離富集蝦肉樣品的氯霉素殘留。將樣品用免疫親和層析柱預(yù)處理，再用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測，在準確可靠的前提條件下，使得樣品預(yù)處理的操作簡單高效化，從而縮短分析時間，達

4、到了簡單便捷，高效可靠的目標。本研究采用的免疫親和柱，是把Protein G 樹脂膠純化的氯霉素的單克隆抗體，和溴化氰活化Sepharose 4B瓊脂糖凝珠共價結(jié)合交聯(lián)，再將此種復(fù)合物分裝進EP管中制備而成的多個微型小“柱”。經(jīng)過實驗的驗證，實際樣品蝦肉能夠用采用這種方法制備的免疫親和色譜柱分析：它能將氯霉素從蝦肉樣品中提取分離，每50L柱膠的最大柱容量為200ng每50L柱膠。在探究上樣、淋洗和洗脫的條件后，建立梯度濃度氯霉素標液的S型曲線測定，找到了線性關(guān)系、檢測限，線性范圍內(nèi)標液的回收率為78.9%-129.9%。之后的實際樣品的加標測定結(jié)果為：蝦肉和奶粉加標量分別為 2ng g1時，回

5、收率在80%左右，奶粉達到了90%。為保證實驗嚴謹，還進行了空白樣品過柱實驗作為陰性對照，并用HPLC-MS/MS進行測定無信號證明蝦肉基質(zhì)本身呈陰性。關(guān)鍵詞：樣品預(yù)處理 免疫親和層析柱 蝦肉檢測 氯霉素 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 食品安全AbstractFood safety and peoples livelihood attracts attention a lot. Food safety is undoubtedly a kind of great science that permeates the small peoples livelihood. How to ensure pe

6、oples food security, health and life quality? This is a grim situation that calls for us to establish an effective detection method for harmful toxic substances contained in food. This method should be simple, convenient, efficient and reliable as well. Chloramphenicol as a kind of antibiotic that h

7、armful to human health, is often abused in agricultural water products ,so its naturally to carry out a kind of convenient detection of it. The aim of this experiment was to establish a single component of chloramphenicol immunoaffinity chromatography for the extraction of chloramphenicol residues i

8、n the samples. The sample pretreatment with immune affinity chromatography column, then detect with HPLC-MS/MS detection, at the same time ensuring the premise that accurate and reliable, make sample pretreatment operation simple and efficient, so as to shorten the analysis time, to achieve a simple

9、 and convenient, reliable and efficient target.The immune affinity column used in this research adopts chloramphenicol monoclonal antibody that has been purified and dialysis with the Protein G resin, covalently combine with CNBr activated Sepharose 4B gel beads, then repackage this compound into EP

10、 tube into multiple tiny little column. As the experimental verification shows, the actual samples of the preparation of shrimp can use this immune affinity chromatography column way to analysis: it can do extraction and separation of chloramphenicol from the shrimp samples, every 50L column glue ha

11、s the maximum column capacity of 200ng. On inquiry, leaching and elution conditions, establish the gradient concentration determination of chloramphenicol to draw a standard curve that give us the linearity, detection limit and the recovery rate of the fluid inside the limits of 78.9%-129.9%.The res

12、ult of the addition of the actual sample was: 2ng g-1,recovery of shrimp on average is 80% and for milk its 90%.In order to conduct an accurate enough experiment, the blank sample was carried out as the negative control, with detection using HPLC-MS/MS.The outcome shows relative standard deviation o

13、f the real sample is blank.Keywords: specimen pretreatment, immune affinity chromatography column ，shrimp flesh detection, chloramphenicol, HPLC-MS/MS, food safety.第一章 緒論 1.1 引言對樣品進行分析測試的整個流程大致為：目標樣品的收集，樣品的分解，樣品凈化，樣品進樣前的處理和樣品上機測定一共五個流程，并且除了樣品的測定外，剩余步驟粗泛而言都屬于樣品預(yù)處理。對于從事分析化學(xué)的科研人員來說，我們主要關(guān)注樣品分解和凈化兩個環(huán)節(jié)，這是

14、狹義分析預(yù)處理環(huán)節(jié)1。我們的目的就是將待檢測的樣品處理成滿足儀器分析要求的性態(tài)，而且在絕大多數(shù)情況下要處理成溶液的樣品狀態(tài)。樣品預(yù)處理是檢測與分析工作中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。從時長來講，分析過程約60%以上的時間都在樣品預(yù)處理這一步耗費；從實驗本身來講，樣品預(yù)處理環(huán)節(jié)是的分析誤差的主要來源。因此，樣品的前處理技術(shù)是否科學(xué)簡便，決定著著分析化學(xué)技術(shù)發(fā)展的順暢與否。1.2 新型樣品前處理技術(shù)的評價及發(fā)展1.2.1 樣品前處理方法的評價 樣品預(yù)處理，概括來說是獲得樣品后將其中的目標組分提取、凈化、濃縮、復(fù)溶到需要狀態(tài)的全過程。首要目標是維護儀器安全，避免基質(zhì)對實驗結(jié)果造成干擾，提高所用檢測方法的選擇性、準確度

15、、靈敏度，降低檢測限2。因此，這些標準也就自然而然的成為對樣品前處理方法評價的標準。首先，方法的選擇要有針對性，依據(jù)樣品中殘留物質(zhì)的不同特點而靈活參考。因此，怎樣因材施法，將最適合的方法應(yīng)用于所分析樣品是關(guān)鍵問題。所以我們應(yīng)該考慮多種因素作為評價預(yù)處理方法的標準：是否濃縮了樣本，使得方法的靈敏度對應(yīng)提高、回收率高低、基質(zhì)干擾，人力物力的耗費、所要求檢測條件苛刻與否、是否可以重復(fù)實驗結(jié)果等3。所有因素要綜合考慮，不能把優(yōu)勢以偏概全，也不能看到缺點就因噎廢食。1.2.2 樣品預(yù)處理方式及適用條件數(shù)量眾多的樣品預(yù)處理方式各有其原理與適用范圍4，如表1.1所示。 表1.1樣品預(yù)處理方式的原理及應(yīng)用范圍

16、 1.2.3 常用預(yù)處理方法：固相萃取技術(shù)我們常用SPE代表固相萃取技術(shù)，它是現(xiàn)今許多實驗室和單位常用的樣品處理方法。常常用于純化生物產(chǎn)品，用于臨床醫(yī)學(xué)，生物化學(xué)，法醫(yī)學(xué)和藥物研究等領(lǐng)域的進一步分析5。SPE的普及部分歸因于它實現(xiàn)較高的選擇性和回收率，易于使用以及對危險萃取溶劑的消耗較少等實用性6。它作為一種凈化技術(shù)常與液相色譜聯(lián)用，目前這種應(yīng)用非常普遍7。比如環(huán)境樣品分析、食品樣品分析以及藥物檢測，生物樣品分析等8。目前商業(yè)上應(yīng)用比較廣泛的預(yù)處理耗材就是SPE柱，柱床是一個長約十厘米的塑料小柱，填料根據(jù)目標物特性各有不同。使用時先活化洗滌，再將樣品溶液稀釋一定比例后從柱上口加入，樣品溶液通過

17、SPE柱下端流入貯液器中。樣品溶液過柱后洗滌吹干，可在柱下端出口處減壓抽氣，或于柱上口加壓。最后用適當溶液洗脫，洗脫液用離心管或試管收集即完成凈化9。1.2.4 樣品預(yù)處理技術(shù)的發(fā)展隨著科學(xué)技術(shù)的進步和科研工作者的開發(fā)研究，樣品前處理技術(shù)有了新的發(fā)展。10但尋求利大于弊，適用性更佳的樣品預(yù)處理新方法研工作者孜孜以求的目標，是目前分析化學(xué)這門學(xué)科面臨的一個亟待解決的問題。在傳統(tǒng)預(yù)處理仍被應(yīng)用的同時，科學(xué)家根據(jù)凈化原理進一步改進，對待測樣本“量體裁衣”，結(jié)合新的微波、超臨界流體等技術(shù)，創(chuàng)造拓展了新的樣品預(yù)處理領(lǐng)域。超臨界流體萃取法、固相微萃取法、液膜萃取法、微波輔助萃取法等，都是最近幾年興起并發(fā)展

18、迅速的預(yù)處理方法，這些方法被越來越多人推崇的很大原因歸結(jié)于它們減少或避免了有害溶劑的使用。未來，樣品前處理將更多地向綠色化學(xué)(無溶劑)、樣品微量化、裝置小型化發(fā)展。較為突出的，如固相微萃取(SPME)技術(shù)已日益成熟并成為多個領(lǐng)域應(yīng)用中的標準方法，應(yīng)用越來越廣泛。液相微萃取(LPME)克服了傳統(tǒng)液-液萃取技術(shù)繁瑣、浪費、污染等缺點，具有消耗溶劑少(僅需L級)，富集倍數(shù)大，萃取效率高，操作更簡便，便于實現(xiàn)分析的自動化等突出優(yōu)點，被廣泛研究和應(yīng)用，有著很大發(fā)展?jié)摿?。此外，新型的吸附介質(zhì)如石墨烯等各種納米材料、磁性介質(zhì)等也被大量用于樣品前處理，未來實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)后，將可能大大提高樣品前處理的效率11。

19、1.3 免疫分析免疫分析：一種生物化學(xué)分析方法，原理是抗原抗體特異性結(jié)合，種類包含酶聯(lián)免疫分析，免疫親和層析柱等，給予免疫原理的分析方法往往靈敏度高且特異性強12。1.3.1 抗原 抗原(Antigen，Ag)能夠刺激機體的免疫系統(tǒng)，然后誘導(dǎo)動物機體發(fā)生免疫應(yīng)答。12抗原最基本的兩個特性是：異物性，它在結(jié)構(gòu)上和自身機體不一樣，異種物質(zhì)或者同種異體物質(zhì)都包含在內(nèi)；大分子性，一般擁有一萬以上的分子質(zhì)量，并且分子質(zhì)量越大，抗原的特異性就越強13；免疫原性，一種誘發(fā)免疫應(yīng)答的能力；二：抗原性，與免疫應(yīng)答產(chǎn)物相反應(yīng)的能力。根據(jù)抗原特質(zhì)，可把它分為兩類： 如表1.2中所示。表1.2 抗原分類不同抗原如何區(qū)

20、分定義？不同抗原的獨特性來自不同抗原決定簇。這種獨特性表現(xiàn)在兩個方面：一種抗原僅能引發(fā)一種免疫應(yīng)答；只有由抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細胞才能與抗原結(jié)合。14還有一種普遍的情況：同一類的化合物，某種抗原決定簇也會出現(xiàn)在其他化合物上，這兩種化合物擁有重合的部分稱為共同抗原表位，也叫交叉抗原(Cross antigen)，能夠與類似物刺激產(chǎn)的抗體發(fā)生交叉反應(yīng)(Cross reaction)15。例如：氯霉素，氟苯尼考，甲砜霉素等化合物都是一類結(jié)構(gòu)性質(zhì)相近的小分子化合物，均屬于半抗原。半抗原修飾的方法可以將其轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆乖?，用載體連接的小分子才能有免疫原性，進而刺激機體，產(chǎn)生抗體。 1.3.2 抗體

21、圖1.1 抗體結(jié)構(gòu)圖抗體結(jié)構(gòu)如圖1.1所示，它本質(zhì)上是與特定抗原進行結(jié)合得的糖蛋白類免疫球蛋白(Ig)。在體內(nèi),抗體是由外源分子的侵襲，免疫系統(tǒng)受刺激而產(chǎn)生的。抗體由 4 條多肽鏈組成Y形狀分子, 其中兩條較長、分子量較大的相同的重鏈；兩條較短，分子質(zhì)量較小的相同的輕鏈。鏈間由二硫鍵和非共價鍵聯(lián)結(jié)成一個整體分子。輕鏈有k和兩種，重鏈有、和五種。給定的物種，不同的抗體分子具有幾乎相同的頂端鏈上氨基酸序列和種類，叫做C區(qū)，恒定區(qū)。16而位于Y形狀末端的一小段相對不穩(wěn)定的部分叫可變區(qū)。任何一個抗體位于Y形狀末端的部位是抗原結(jié)合片段，F(xiàn)ab，柄部是結(jié)晶片段，F(xiàn)c端。1.3.3 抗原抗體反應(yīng)抗原抗體擁有

22、“鎖和鑰匙”結(jié)構(gòu)，這種結(jié)合可以發(fā)生在體內(nèi)外。這一重要原理是免 疫 分 析 之 基 礎(chǔ)。它們之間的結(jié)合異常迅速，只需幾秒。先以氫鍵結(jié)合脫水，然后緊密結(jié)合為成分子間的非共價鍵。17值得注意的是，抗原和抗體的反應(yīng)有：特異性、可逆性和比例性。特異性在前文介紹抗原時已經(jīng)指出，結(jié)合的抗原抗體只能一一對應(yīng)?？赡嫘灾傅氖钱斂乖c抗體結(jié)合后，還可以重新解離成為游離抗原和抗體的性質(zhì)，當然這種解離需要與結(jié)合時要求不同的特定的條件。而比例性，就是抗原抗體要符合一定比例，合適的比例會使得它們相互之間結(jié)合最牢固?？乖贵w兩者中任何一個濃度不合適對反應(yīng)都會有影響?？乖贵w之間的反應(yīng)受非常復(fù)雜的條件影響，有些條件促進結(jié)合，有

23、些條件促進解離。精確掌握抗原抗體反映的特性條件，就可以利用免疫親和的方法來分離并且純化抗原。181.4 免疫親和層析柱（IAC）1.4.1 簡述及現(xiàn)狀隨著科研進程中實驗的進行與經(jīng)驗的積累，涌現(xiàn)針對各式各樣樣品適用的預(yù)處理方法，在具有針對性強的優(yōu)勢的同時還存在一些不足。而IAC可以克服許多預(yù)處理中遇到的問題，從而使實驗順利進行。它利用的是抗原抗體“鎖和鑰匙”結(jié)合而又可逆的原理，因此制備的IAC柱就具有獨特的選擇性、專一性和良好的吸附凈化性，日益成為了一種實用性強度的藥品毒素殘留檢測的凈化技術(shù)。IAC在食品安全檢測中的應(yīng)用非常廣泛，涵蓋糧油中的真菌霉素，農(nóng)產(chǎn)品水產(chǎn)品中獸藥的檢測，以及一些毒性物質(zhì)的

24、凈化檢測。191.4.2 IAC 的原理 免疫親和柱技術(shù)原理是：柱床內(nèi)裝有柱膠，這種柱膠是由特定的單克隆抗體與瓊脂糖凝膠交聯(lián)而成的懸浮物，20這樣的抗體交聯(lián)物，對某種特定抗原有特異性吸附的功能。 由于生物大分子（抗原）和配基（抗體）的結(jié)合是專一可逆的，此通過選擇適當配基與生物大分子專一性地結(jié)合，然后調(diào)整洗脫液的組成，將目標物洗脫圖1.2 免疫親和層析原理使其流出親和柱，最后能夠同時達到萃取、純化、分離，目標物質(zhì)的成效，方便的進行下一步上機檢測。1.4.3 IAC的優(yōu)勢(1) 簡化許多繁瑣的樣品預(yù)處理的步驟； (2) 樣品純化回收率高的同時耗時短，達到高效的結(jié)果 (3) 經(jīng)過IAC預(yù)處理的樣品純

25、度可以達到很多方法和精密儀器檢測的要求。(4) 即使樣品復(fù)雜也能保證很高的靈敏度 (5) 由于抗原抗體的特異性，IAC具有定性的作用(6) 根據(jù)抗體交叉反應(yīng)的性質(zhì)，可以用于單組分或多組分分析。21第二章 氯霉素單組分免疫親和色譜法的建立2.1 氯霉素檢測方法的現(xiàn)狀目前有關(guān)動物源性食品中氯霉素及其代謝物的測定方法主要為理化檢測法，如用化學(xué)分析法測定蝦肉中的氯霉素殘留量，測定魚肉中的氯霉素殘留量。但這些方法儀器設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，靈敏度低，且不適用于大批量樣品的檢測22 。2.2 氯霉素圖2.1氯霉素分子結(jié)構(gòu)2.2.1 氯霉素分類 氯霉素還有其衍生物甲砜霉素，氟苯尼考都是抗生素。從免疫分析學(xué)科上來

26、講，三者具有相似的抗原表位。甲砜霉素的抗菌效果比氯霉素的效果差些，常常用于家禽和羊呼吸道疾病消化系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療。氟苯尼考，是氯霉素的又一種替代品抗菌效果更佳。232.2.2氯霉素檢測方法表2.1抗生素氯霉素檢測方式242.3 本課題的研究意義及目的經(jīng)濟水平日益提升，民眾對生活、對“食”有了進一步質(zhì)的需求。本實驗從氯霉素作半抗原制備的幾株單克隆雜交瘤細胞株中遴選出一株細胞2D2，其誘生的單抗腹水樣本具有高靈敏度、強特異性。24對所產(chǎn)腹水做了間接競爭的ELISA試驗，結(jié)果表明該腹水中抗體對氯霉素有極高的檢測靈敏度（IC50為0.45ppb）和效價（效價為1：140000），從交叉反應(yīng)實驗也證

27、明了氯霉素單克隆抗體的特異性強（對氯霉素的交叉反應(yīng)率為100%，對其他免疫交叉率均0.01%）?；谝陨纤雎让顾貑慰寺】贵w的有益效果，本實驗提供了所述氯霉素免疫親和層析色譜膠；前處理對象為氯霉素標準品摻入的標準緩沖液以及摻入氯霉素的標準空白蝦肉作為模式基質(zhì)的試樣。本實驗選用針對氯霉素具有高靈敏度和強特異性識別與結(jié)合的單抗，將其作為核心試劑應(yīng)用于免疫親和層析膠研制中，其產(chǎn)品對目標物同樣具有高選擇性、高親和力等特性；以此作為新型機測樣本前處理模式能有效去除待測樣本的基質(zhì)干擾，獲得高回收率、高純度目標物L(fēng)C-MS/MS作確證和精確定量分析；2526與傳統(tǒng)固相萃取前處理模式比較發(fā)現(xiàn)，這種新型前處理模

28、式在操作便捷性、樣本凈化通量、目標物回收率、機測峰型27等指標優(yōu)于傳統(tǒng)理化前處理， 28拓展了HPLC-FLD/LC-MS/MS檢測氯霉素殘留樣本的應(yīng)用領(lǐng)域。 2.4 實驗材料2.4.1 實驗試劑2.4.2 溶液配制2.4.3 實驗儀器和設(shè)備2.5 實驗部分2.5.1操作條件 2.5.1.1高效液相色譜條件色譜柱：MGC18，100mm2.0mm（i.d.），粒徑5m；（CAPCELL PAK）柱溫：40進樣量：7.5L濾膜：0.22m水系濾膜流動相：流動相A：MeOH 流動相B: 水流動相梯度洗脫條件：時間A%B%流速（mL/min）0.0020800.31.0020800.33.00901

29、00.34.0090100.35.0020800.3表2.2高效液相色譜梯度洗脫條件2.5.1.2 質(zhì)譜條件離子源：ESI掃描方式：負離子掃描檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測電離電壓：4.0kV霧化溫度：350攝氏度霧化氣流速：30L/h碰撞氣：氬氣CAP定性離子對：320.9257.0或320.9152.0CAP定量離子對：320.9152.0去簇電壓：114V碰撞能量：16或24eV2.5.2 抗體的獲取與純化2D2雜交瘤細胞株細胞懸液注射的小鼠的腹腔，一星期后采集腹水，1000 r/min離心10min去細胞去佐劑（浮在上層的免疫致敏劑），取含有抗體的上清后12000r/min 離心30min以去除

30、腹水中細胞碎片，-20凍存?zhèn)溆?。純化前取腹水解凍備用。備塑料柱床，用純水和PBS （pH=8.0）多次清洗柱床。Protein G對小鼠IgG親和力強，加4ml 50% Protein G resin膠懸濁液，用PBS （pH=8.0）沉降。PBS （pH=8.0）淘洗50個柱膠體積后柱膠基本壓實，取腹水，5000rpm離心去除固態(tài)雜質(zhì)后取上清，用冷PBS （pH=8.0） 三倍稀釋，取出20L做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳純度對照。放液，柱膠將干未干時第一次加腹水，少量多次以防止滴穿，冰浴過5次柱防止抗體失活。最后冷PBS （pH=8.0）再次洗滌50個柱膠體積，最后3次洗滌要求將干未干，防止后

31、續(xù)收集時造成死腔。用預(yù)冷的Glycine（pH=2.5）將抗體洗脫，接收在預(yù)裝有100LTris-HCl 8.5緩沖液的EP管中，共接12管。60mL冷Glycine （pH=2.5）洗滌柱，用PBS （pH=8.0）洗50柱膠體積。重復(fù)第四步將第二批腹水純化，結(jié)束后用 PBS（pH=8.0）洗滌存放柱膠，并取奇數(shù)管20L純化后抗體做BCA，篩選信號強的管合并置于7500-14000MW透析袋中用PBS （pH=7.4）透析冰箱中進行透析。取20L透析液做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳與原腹水對照，換交聯(lián)緩沖液(CBS 8.3)繼續(xù)透析。純化單抗蛋白，于500mL 0.1M NaHCO3/0.5M

32、NaCl (pH8.3)緩沖溶液中4透析過夜，每4-6h換液一次。圖2.2抗體純化2.5.3 抗體蛋白含量的測定Bicinchoninic acid，聚氰基丙烯酸正丁酯，而BCA試劑盒A液CuSO4與B液NaOH混合，配制一系列標準蛋白梯度孔，加混液200L。蛋白質(zhì)將AB混和溶液中的Cu2+經(jīng)雙縮脲反應(yīng)還原為Cu+，BCA 與生成的Cu+高度特異性結(jié)合，產(chǎn)生紫色的復(fù)合物，蛋白質(zhì)的濃度越大BCA呈現(xiàn)的紫色越深。在562nm出測定吸光值繪制標準曲線并將樣本吸光度帶入。由于實驗室酶標儀沒有562nm光，故采用相近的490nm測定。定量方法還可采用公式：1.51OD280-0.73OD260。2.5.

33、4抗體純度測定十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） ，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量與電荷量的不同通過電泳形成不同運動速度的區(qū)帶，加以標準質(zhì)量蛋白質(zhì)作為參照，可以得知待測蛋白質(zhì)鏈的分子量。取樣品20L，加等體積的溴酚藍染料染色，沸水煮10min后，12000r/min離心10min，在聚丙烯酰胺網(wǎng)狀凝膠中進行電泳，首先加壓200V，30min后用80V繼續(xù)電泳3h，蛋白質(zhì)分子的電荷及其分子量差異使其遷移率不同形成不同區(qū)帶。2.5.5 氯霉素免疫親和柱的制備根據(jù)文獻以及經(jīng)驗值，樹脂微球和抗體交聯(lián)的比例關(guān)系：1mL膠=0.3g Sepharose 4B 凍干粉=5-8mg單抗。但為保證抗體不浪費

34、，一般多取一些凍干粉。1.將CNBr-activated Sepharose 4B進行溶脹、淘洗，具體操作為：稱取CNBr-activated Sepharose 4B凍干粉0.92g，加入溶脹微球的稀HCl 40mL，離心棄上清，加入稀HCl離心洗滌以去除CNBr-activated SepharoseTM 4B膠中其他小分子化學(xué)試劑后，再用NaHCO3/NaCl緩沖溶液40mL離心洗滌一次，備用。2.預(yù)處理的純化單抗蛋白中加入至含步驟1所述處理膠的50ml離心管中，蓋好并用parafilm膜封口，置于擺床中室溫擺動孵育1h，2000r/min離心10min棄上清。稍高的溫度可以使樹脂微球與

35、抗體結(jié)合效率增大。離心管中加入30ml的0.1M NaHCO3/0.5M NaCl緩沖溶液，置于擺床中室溫擺動10min，再用與之前相同的條件反復(fù)離心洗滌5-6次，由此盡量完全去除未交聯(lián)的蛋白和一些雜質(zhì)，即獲得抗體-蛋白交聯(lián)膠。取上清液再做一次BCA蛋白測定，若無紫色則確保交聯(lián)成功。取步驟2抗體-蛋白交聯(lián)膠，離心管加入40ml 0.1M Tris-HCl置于擺床中室溫擺動孵育2h以充分封閉抗體蛋白交聯(lián)膠中未與蛋白交聯(lián)的活化基團，用2000r/min轉(zhuǎn)速離心10min后棄去上清液，裝有交聯(lián)膠的離心管分別用40ml 0.1M HAC-NaAC/0.5M NaCl和40ml 0.1M Tris-HC

36、l/0.5M NaCl兩種緩沖液交替進行洗滌離心三個循環(huán)，這一步的目的是除去非共價形式的交聯(lián)，比如弱離子鍵交聯(lián)。將交聯(lián)膠重懸于十倍膠體積0.1M Tris-HCl/0.5M NaCl緩沖液并，如長期不用，要補加防腐抗菌劑0.02% NaN3，于0保存?zhèn)溆?，即獲得所述免疫親和層析色譜膠。252.5.6 氯霉素免疫親和柱的表征2.5.6.1氯霉素免疫親和柱指標測定氯霉素結(jié)合性能指標測定的方法，包括：取純水配制的1mg/m氯霉素儲存液，用純水將每種藥物分別稀釋成：0、0.1、0.3、1、5、10、20、30、50、200、400ng/ml十一個濃度點和空白對照點于5ml EP 管中（4ml/管）（經(jīng)

37、抗體與氯霉素質(zhì)量比率計算柱容量理論值遠小于500ng）。另取11支1.5ml EP管，每管均加入500l免疫親和層析膠懸液（層析膠實際壓積為50l），用0.01M PBS（pH 7.4）離心洗滌二次盡量吸干PBS后，分別將每種藥物各濃度點的稀釋管液一一對應(yīng)移入含免疫層析膠EP 管中。將各濃度點結(jié)合膠輕輕懸浮后，于擺床室溫擺動孵育1h，1000r/min 離心10min棄上清，用0.01M PBS（pH 7.4）離心洗滌3-5次，再用純水離心洗滌2次，盡量吸干膠中殘液。低的pH可以使交聯(lián)膠結(jié)合能力下降，而有機溶劑促進氯霉素洗脫溶解，洗脫液具有揮發(fā)性物質(zhì)可以減少HPLC進樣緩沖的步驟，因此選用1m

38、l 0.1% 甲酸 (pH2.2)重懸結(jié)合膠，并于擺床室溫擺動15min，1000r/min 離心10min。為維護HPLC-MS/MS儀器，將樣品均稀釋在最終濃度10ng/ml以下，最后分別用1ml一次性注射器抽取每個處理上清800L一一對應(yīng)用0.22m水系濾膜過濾至進樣管，進LC-MS/MS作確證和精確定量測定。進樣機測后，判讀各濃度點的機測信號：以信號峰：基線峰比值3的對應(yīng)濃度為檢出限；以二者比值10的對應(yīng)濃度為定量限；以添加標準品各濃度的值作橫坐標，以機測信號峰面積作為縱坐標計算每一個濃度樣品所對應(yīng)的回收率；以機測信號換算濃度不再上升對應(yīng)最小濃度點為最大吸附量。 2.5.6.2 樣品處

39、理方法為保證樣品中不含有氯霉素殘留，基質(zhì)蝦肉為市場采購太湖野生蝦。首先要將蝦肉進行初步處理：將蝦肉樣品充分剪碎再加入適量水勻漿，稱取每份 2 g 的蝦肉泥于 50 m L 離心管中，作為陰性對照的空白樣品不加氯霉素，其余分別加入梯度濃度10、20、30、40、50ng/g的標準工作液的氯霉素標準溶液，渦旋混勻。加入3g無水硫酸鈉除水，12mL乙酸乙酯萃取CAP，渦旋震蕩使得CAP充分被乙酸乙酯萃取出來。6000r/min離心4min除雜，吸取上清液9mL（EA添加量的3/4）于15mL離心管中，50水浴用氮吹儀吹干，加入3mL水復(fù)溶，渦旋混勻。加入3mL正己烷除脂，5000r/min離心4mi

40、n，然后靜置 15 min。將正己烷吸出，余下液體取1mL用于上樣IAC和SPE柱。這一步進行完后原加標的濃度相當于兩倍稀釋了。備用過柱。對于奶粉和飼料樣品，進行同樣的加標處理方法，但不需要除脂除水。2.5.6.3 樣品的測定每管均加入500l免疫親和層析膠懸液（層析膠實際壓積為50l），用0.01M PBS（pH 7.4）離心洗滌二次盡量吸干PBS后，分別將加標處理復(fù)溶好的樣品加入含免疫層析膠EP 管中。將各濃度結(jié)合膠輕輕懸浮后，于擺床室溫擺動孵育1h，1000r/min 離心10min棄上清，用0.01M PBS（pH 7.4）離心洗滌3-5次，再用純水離心洗滌2次，盡量吸干膠中殘液。選用

41、1ml 0.1% 甲酸 (pH2.2)重懸結(jié)合膠，并于擺床室溫擺動15min，1000r/min 離心10min。為維護HPLC-MS/MS儀器，將樣品均稀釋在最終濃度10ng/ml以下，最后分別用1ml一次性注射器抽取每個處理上清800L一一對應(yīng)用0.22m水系濾膜過濾至進樣管，進LC-MS/MS作確證和精確定量測定，最后計算加標回收率。2.5.6.4與國標傳統(tǒng)SPE柱凈化方法對比根據(jù)GB/T18932.19-2003提到的方法：26樣品提取同2.5.6.2中所述。凈化具體操作為：將Waters HLB小柱用甲醇活化后再用共10mL水清洗3次，此時提前將流速控制在3mL/min。上樣過柱，緩

42、慢添加防止CAP大量吸附在柱壁上。待溶液完全流出后，用3mL乙腈+水（10mL乙腈與70mL水混合）洗滌柱。27乙腈水盡量流干，為促進可用洗耳球吹，靜置一段時間。最后用3mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液與10mL具塞試管中，與50水浴中用氮氣吹干儀吹干，用1-5mL水復(fù)溶稀釋，渦旋混勻后用加濾膜的注射器分別收集在進樣瓶中待上機測定。每管均加入500l免疫親和層析膠懸液（層析膠實際壓積為50l），用0.01M PBS（pH 7.4）離心洗滌二次盡量吸干PBS后，分別將每種藥物各濃度點的稀釋管液一一對應(yīng)移入含免疫層析膠EP 管中。將各濃度點結(jié)合膠輕輕懸浮后，于擺床室溫擺動孵育1h，1000r/min

43、離心10min棄上清，用0.01M PBS（pH 7.4）離心洗滌3-5次，再用純水離心洗滌2次，盡量吸干膠中殘液。低的pH可以使交聯(lián)膠結(jié)合能力下降，而有機溶劑促進氯霉素洗脫溶解，洗脫液具有揮發(fā)性物質(zhì)可以減少HPLC進樣緩沖的步驟，因此選用1ml 0.1% 甲酸 (pH2.2)重懸結(jié)合膠，并于擺床室溫擺動15min，1000r/min 離心10min。為維護HPLC-MS/MS儀器，將樣品均稀釋在最終濃度10ng/ml以下，最后分別用1ml一次性注射器抽取每個處理上清800L一一對應(yīng)用0.22m水系濾膜過濾至進樣管，進LC-MS/MS作確證和精確定量測定。2.7 結(jié)果與討論2.7.1 氯霉素抗

44、體濃度的測定 圖2.3 BCA標準曲線此為BCA標準蛋白的濃度-吸光度繪制標準曲線，將待測樣本兩個平行樣的吸光度取均值帶入曲線，得到抗體的量：3月15日第一批純化蛋白濃度1.33mg/mL，共10mL，13.3mg；4月1日第二批純化蛋白濃度1.05mg/mL，共15mL，15.8mg。2.7.2 氯霉素抗體純度的測定腹水樣本通過protein G resin 一步法來純化單抗蛋白，SDS-PAGE 電泳鑒定結(jié)果顯示：腹水純化物僅有含50Kd（抗體重鏈）和25Kd（抗體輕鏈）二條明顯蛋白條帶，無其他雜蛋白帶，表明通過該雜交瘤細胞株誘生腹水原料經(jīng)處理可獲得高濃度、高純度單抗蛋白，可以滿足制備免疫

45、親和層析膠中檢測抗體的量和純度需求。圖2.4抗體純化結(jié)果2.7.3 IAC交聯(lián)程度測定取交聯(lián)結(jié)束后的膠500rpm離心，取上清液再做一次BCA蛋白測定，BCA結(jié)果呈現(xiàn)綠色（BCA試劑本身顏色），殘余溶液中不存在蛋白質(zhì)，證明交聯(lián)成功，吸光度測定顯示交聯(lián)程度大于95%。2.7.4 氯霉素免疫親和柱特性表征試驗濃度（ng/ml）檢出限（ng/ml）定量限（ng/ml）結(jié)合容量（ng/L）回收率（%）00.10.110.80.30.378.91129.9592.31079.52073.13095.15098.7100106.120020020067.540012.3表2.3氯霉素IAC表征指標由上表可

46、以看出，IAC凈化氯霉素用LC-MS/MS檢測的靈敏度在0.1ng/mL以下，從0.3 ng/mL到100ng/mL呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，一直到100ng/mL回收率仍維持在較高的范圍內(nèi)。濃度大于200ng/mL時回收率開始有了大幅度下降。故本方法的定量限0.3，有效檢測范圍0.3-100ng/mL。我們還可以得知結(jié)合容量（最大柱容量）落在回收率仍未大幅度下降的范圍內(nèi)，每50L柱膠抗體可以結(jié)合200ng氯霉素。 回歸方程：y = 118.86 x + -59.84 (r = 0.9938)圖2.5 氯霉素標準品IAC標準曲線2.7.5 對比SPE柱凈化結(jié)果討論表2.4免疫親和層析法與固相萃取法

47、對氯霉素摻入蝦肉凈化后的LC-MS/MS定量對比分析摻入蝦肉中濃度(ng/ml)免疫親和層析法凈化固相萃取凈化（國標）回收率(%)回收率(%)01083.262.52069.255.53080.760.84077.636.15079.651.2摻入奶粉中濃度(ng/ml)免疫親和層析法凈化固相萃取凈化（國標）回收率(%)回收率(%)01106.986.91090.577.15091.873.8經(jīng)LC-MS/MS測定結(jié)果顯示：針對系列濃度氯霉素摻入空白蝦肉模式待測樣本，試樣經(jīng)LC-MS/MS精確定量分析：與固相萃取凈化組相比，免疫親和層析凈化組在有效檢測濃度域內(nèi)，免疫親和層析凈化組的回收率顯著高

48、于固相萃取凈化組的回收率，上述定量指標表明免疫親和層析作為新型處理模式其處理效果優(yōu)于傳統(tǒng)前處理模式?？偨Y(jié)昔年本科生涯匆匆而過，氯霉素單組分免疫親和色譜法的研究不僅是我的畢業(yè)設(shè)計，同時它也是我真正科研生活的開端。本課題的確定是基于目前國內(nèi)對食品安全的日益關(guān)注以及實驗室的研究背景。該課題具有很大的實際應(yīng)用價值，研究方法可靠。實驗氯霉素單組分免疫親和色譜法的研究。實驗主要是基于實驗室成功合成的氯霉素單克隆抗體而制備的免疫親和柱。預(yù)處理方法主要包括免疫親和柱部分：抗體的純化、免疫親和柱的制備、免疫親和柱的檢測限，靈敏度、柱容量等性質(zhì)測定、與傳統(tǒng)SPE柱凈化效果的對比、真實樣品蝦肉的測定。實驗的過程并非

49、一帆風(fēng)順，純化好的抗體交聯(lián)時曾加錯了溶液導(dǎo)致前功盡棄，上機測定時標準曲線因為濃度設(shè)計的不好結(jié)果不好，好在一切磕磕絆絆都得以解決，因為科研人每一步不缺從頭再來的勇氣。 結(jié)果是成功制備了能夠在基質(zhì)中有效提取氯霉素的的免疫親和柱，進而用 HPLC-MS/MS 進行定性定量檢測的分析方法，首先測定了免疫親和柱自身柱特性，用此種方法處理過的樣品檢出限在0.1ng/mL以下，定量限是0.3ng/mL，有效檢測范圍是0.3-100ng/mL，結(jié)合容量為每50L膠可以吸附200ng樣品。將此種方法應(yīng)用于實際樣品（蝦肉）的處理中，回收率為平均值超過了80%，且傳統(tǒng)SPE柱回收率平均值在60%以下，數(shù)據(jù)證明了我們

50、建立的氯霉素免疫親和預(yù)處理方法可靠而準確，對于實際樣品的分析實驗具有廣闊的前景和價值。參考文獻1Ireneusz Sowa,Magdalena Wjciak-Kosior,Kamila Rokicka,Ryszard Kocjan,Grayna Szymczak. Application of solid phase extraction with the use of silica modified with polyaniline film for pretreatment of samples from plant material before HPLC determination o

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