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1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究概述 摘要 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是生物、生物醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法,可分為原代和傳代培養(yǎng),有貼壁、懸浮和固定化培養(yǎng)等培養(yǎng)方式。細(xì)胞生長具有特殊的生物學(xué)性質(zhì),需要無菌、恒溫和充分的營養(yǎng)環(huán)境.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在擁有廣闊的發(fā)展空間和光明前景的同時(shí)也面臨著諸多問題和挑戰(zhàn)。 關(guān)鍵詞 細(xì)胞培養(yǎng);微載體;中空纖維;微囊法培養(yǎng)1、 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展 動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)最早可追溯到1907年,由美國生物學(xué)家Harrison在無菌條件下,以淋巴液為培養(yǎng)基成功地在試管中培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)組織達(dá)數(shù)周,創(chuàng)立了體外組織培養(yǎng)法。此后,隨著抗生素、培養(yǎng)基、培養(yǎng)裝置以及工藝方法的不斷改進(jìn),動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)(An
2、imal cell culture )的研究和應(yīng)用逐步增多和深入,發(fā)展至今已成為在生物、醫(yī)學(xué)研究和應(yīng)用中廣泛采用的技術(shù)方法。其發(fā)展簡史見下表：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展1 年份 技術(shù)發(fā)展概要1907年 Harrison創(chuàng)立體外組織培養(yǎng)法。1951年 Earle等開發(fā)了能促進(jìn)動(dòng)物細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基。1957年 G caff用灌注培養(yǎng)法創(chuàng)造了懸浮細(xì)胞培養(yǎng)史上絕無僅有的110102 1010cells/L的記錄,標(biāo)志著現(xiàn)代灌注概念的誕生。1962年 Cap stile成功地大規(guī)模懸浮培養(yǎng)小鼠腎細(xì)胞(BHK),標(biāo)志著動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培 養(yǎng)技術(shù)的起步。1967年 Van W bezel用DEAE-Sepha
3、rdi A50為載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞獲得成功。1975年 Sarto等在培養(yǎng)基中用激素代替血清使垂體細(xì)胞株GH3在無血清介質(zhì)中生長獲 得成功,預(yù)示著無血清培養(yǎng)技術(shù)的誘人前景。預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。1986年 Demo Bio tech公司首次用微囊化技術(shù)大規(guī)模培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單抗獲得成 功。1989年 Constantinople首次提出大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)過程中的生理狀態(tài)控制,更新了傳 統(tǒng)細(xì)胞培養(yǎng)工藝中優(yōu)化控制之理論。2、 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的概念及生物學(xué)特性（1） 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的基本概念 細(xì)胞培養(yǎng)是指從體內(nèi)組織取出組織細(xì)胞并模擬體其內(nèi)生存環(huán)境,在無菌、適當(dāng)溫度及酸堿度和一定營養(yǎng)條件下,使其生長繁殖
4、并維持結(jié)構(gòu)和功能的一種培養(yǎng)技術(shù)。從體內(nèi)取出細(xì)胞首次培養(yǎng)即為原代培養(yǎng)(Primary Culture),這是細(xì)胞培養(yǎng)的最初和必經(jīng)階段.當(dāng)原代培養(yǎng)細(xì)胞生長到一定時(shí)期,受到群體環(huán)境限制,就需要轉(zhuǎn)移到另一容器才能繼續(xù)生長,稱為傳代或繼代培養(yǎng)(Sub culture)。根據(jù)原代培物性狀的一致性與否,傳代成功后稱為細(xì)胞系(Cell line)或細(xì)胞株(Cell Strain)。這些細(xì)胞一般可順利傳4050代次,并保持染色體二倍體數(shù)量和接觸抑制,傳至50代左右時(shí)則出現(xiàn)生長停滯,大部分衰老死亡,此類稱為有限細(xì)胞系/株;在細(xì)胞傳代的過程中,有些因發(fā)生遺傳突變獲得了持久性增殖能力的細(xì)胞稱為無限細(xì)胞系/株2。（2）
5、 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的生物學(xué)特性 動(dòng)物細(xì)胞無細(xì)胞壁,機(jī)械強(qiáng)度低,對剪切力敏感,適應(yīng)環(huán)境能力差;倍增時(shí)間長,生長緩慢,易受微生物污染;對生長環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境要求苛刻。1. 細(xì)胞生命周期性變化3體外培養(yǎng)的細(xì)胞從適應(yīng)環(huán)境、旺盛生長到由于自身和環(huán)境限制緩慢或停滯生長經(jīng)歷一個(gè)周期變化。 （1）、潛伏期(Latent phase) 細(xì)胞從接種到適應(yīng)新環(huán)境生長繁殖的一段時(shí)間,此間細(xì)胞胞質(zhì)回縮,代謝緩慢. （2）、指數(shù)生長期(Logarithmic phase) 指數(shù)生長期是細(xì)胞活力最好的時(shí)期,細(xì)胞增殖旺盛.在接種細(xì)胞數(shù)量適宜的情況下,指數(shù)生長期持續(xù)35后,隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多,生長空間日趨減少,營養(yǎng)環(huán)境惡化,呈現(xiàn)接觸
6、抑制(Contact inhibition)。惡性細(xì)胞則由于營養(yǎng)成分的消耗和細(xì)胞代謝產(chǎn)物的影響而發(fā)生密度抑制(Density inhibition)。 （3）、穩(wěn)定期(Stagnate phase) 細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和密度后,細(xì)胞與營養(yǎng)液的交換面積減少,代謝產(chǎn)物積累,值下降,細(xì)胞停止增殖,進(jìn)入停滯期.營養(yǎng)環(huán)境繼續(xù)惡化后,細(xì)胞受損直至死亡。2. 細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境和生長條件 （1）、無菌無毒環(huán)境 無菌無毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件.在體外培養(yǎng)的細(xì)胞,由于缺乏對微生物和有毒物的防御能力,一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染,或者自身代謝物質(zhì)積累,就可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞中毒死亡。因此,在體外培養(yǎng)
7、細(xì)胞時(shí),應(yīng)及時(shí)清除細(xì)胞代謝產(chǎn)物,以保持細(xì)胞生存環(huán)境無菌無毒。 （2）、恒溫 要維持培養(yǎng)的細(xì)胞旺盛生長,必須有恒定適宜的溫度.偏離適當(dāng)?shù)臏囟确秶?細(xì)胞會(huì)受到損傷,影響正常代謝甚至死亡。 （3）、氣體環(huán)境 氣體主要是 O2和 CO2，O2可以給細(xì)胞提供能量，而 CO2不僅是細(xì)胞增殖所需的物質(zhì)，也是其自身的代謝產(chǎn)物，此外，CO2還有著調(diào)節(jié)培養(yǎng)基 pH 的作用。 （4）、緩沖環(huán)境 緩沖環(huán)境的作用是為細(xì)胞提供一個(gè)酸堿度在培養(yǎng)細(xì)胞生理范圍內(nèi)的培養(yǎng)液，提供水分和無機(jī)鹽，維持細(xì)胞的正常代謝。 （5）、培養(yǎng)基 培養(yǎng)基是細(xì)胞培養(yǎng)中供給細(xì)胞營養(yǎng)和促進(jìn)增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基兩種，它是細(xì)胞生長繁殖的
8、直接環(huán)境，天然培養(yǎng)基從動(dòng)物體液或組織中分離提取,如血漿、血清、淋巴液、雞胚浸出液等;合成培養(yǎng)基是根據(jù)天然培養(yǎng)基的成分,模擬合成、配制的培養(yǎng)基.它包含細(xì)胞生長的無機(jī)鹽、氨基酸、維生素、糖類等基本物質(zhì)和一些特殊的添加成分結(jié)合適量添加血清,廣泛應(yīng)用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)。3、 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方式（1） 貼壁培養(yǎng)(Mono layer culture) 貼壁培養(yǎng)主要適用于貼壁依賴性細(xì)胞.一般源于實(shí)體組織的細(xì)胞需要相互依賴,需貼附于不起化學(xué)作用的物質(zhì)(玻璃或塑料等無活性物質(zhì))的表面生長、生存和維持,并最終在附著面生長至單層,鋪滿平面時(shí)便會(huì)發(fā)生接觸抑制。（2） 懸浮培養(yǎng)(Suspension culture) 懸
9、浮適應(yīng)細(xì)胞、源于循環(huán)系統(tǒng)的細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等非貼壁依賴性細(xì)胞無需支撐面,細(xì)胞或細(xì)胞聚集體懸浮于液體培養(yǎng)基中增殖.懸浮培養(yǎng)是大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的理想方式。（3） 固定化培養(yǎng)(Immobilizing culture) 固定化培養(yǎng)是一種包埋培養(yǎng)方式,適用于貼壁依賴性細(xì)胞和非貼壁依賴性細(xì)胞.它具有剪切力低、傳遞效果好和抗污染能力強(qiáng)、細(xì)胞生長密度高、產(chǎn)物易于收集和分離純化等特點(diǎn)。（4） 微載體培養(yǎng)(Micro-carrier culture) 傳統(tǒng)的貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)通過靜止或轉(zhuǎn)瓶等培養(yǎng)來獲得,操作繁復(fù),且耗費(fèi)空間及人力。1967年,Van Wezel首次提出了“微載體”培養(yǎng)系統(tǒng),使貼壁依賴型細(xì)胞貼附在微
10、載體上懸浮于液體培養(yǎng)基中生長,兼具平板培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)勢,增加培養(yǎng)面積同時(shí)獲得均一的環(huán)境培養(yǎng)條件(溫度、PH值、CO2濃度、葡萄糖濃度等),便于控制放大獲得高密度培養(yǎng)細(xì)胞和優(yōu)化下游控制。（5） 中空纖維培養(yǎng)(Hollow fib res culture ) 1972年,Richard Knazek首次報(bào)道該技術(shù)4。該技術(shù)是模擬細(xì)胞在體內(nèi)生長的三維狀態(tài),利用一種人工的“毛細(xì)管”即中空纖維給培養(yǎng)的細(xì)胞提供物質(zhì)代謝條件而建立的一種體外培養(yǎng)系統(tǒng)。中空纖維表面具有海綿狀多孔結(jié)構(gòu),既能使水分子、營養(yǎng)物質(zhì)和氣體透過,也能使細(xì)胞在上面貼附生長.該技術(shù)的特點(diǎn)是:細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境溫和,培養(yǎng)細(xì)胞密度較高,產(chǎn)品較容易分
11、離純化5。（6） 微囊法培養(yǎng)6（Micro-encapsulation culture ） 微囊化培養(yǎng)技術(shù)是20世紀(jì)70年代由和創(chuàng)建的一種大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)4.其要點(diǎn)是:在無菌條件下將擬培養(yǎng)的細(xì)胞、生物活性物質(zhì)及生長介質(zhì)共同包裹在薄的半透膜中形成微囊,再將微囊放入培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng).微囊化培養(yǎng)有一些突出的優(yōu)點(diǎn)。首先,細(xì)胞能生長和維持在小體積的培養(yǎng)液中,這使培養(yǎng)液中的分泌產(chǎn)物變濃,簡化了下游加工。其次,培養(yǎng)液易于迅速改變,且無分離細(xì)胞與培養(yǎng)液的困難。最后,微囊固定化細(xì)胞較少暴露于物理損傷環(huán)境。這種技術(shù)最早由Lima7等人提出,Da-mon Bio tech公司8最先實(shí)現(xiàn)工業(yè)化。他們用一層非常薄的聚賴
12、氨酸殼把雜交瘤細(xì)胞囊括起來,形成200m直徑的小球,從培養(yǎng)開始大約10天,雜交瘤細(xì)胞可長滿微囊。據(jù)報(bào)道,微囊中單抗?jié)舛群芨?可達(dá)2. 5g /L,且無其它雜蛋白,容易獲得高純度單抗。目前,微囊工藝已用于生產(chǎn)以克計(jì)的單克隆抗體。高表達(dá)有工業(yè)價(jià)值蛋白質(zhì)的重組細(xì)胞近年來亦更多地用微囊化培養(yǎng)9。4、 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)存在的問題 近一個(gè)世紀(jì)以來，人類對動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的大量研究和開發(fā)，并取得了一定的進(jìn)展。但目前的技術(shù)水平還遠(yuǎn)不能滿足細(xì)胞生物制品開發(fā)和生產(chǎn)的要求。目前存在的問題主要有：各類動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)水平發(fā)展不均衡，特別是低等動(dòng)物類細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)和方法尚不成熟。1. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)效率較低，其成活率和利用率
13、也不理想。2. 在大規(guī)模、長時(shí)間的人工培養(yǎng)過程中，細(xì)胞群體的生理機(jī)能受到影響，如分泌和代謝能力的喪失或代謝產(chǎn)物的活性降低等。3. 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)設(shè)備以及培養(yǎng)用微載體等耗材昂貴，造成研究和開發(fā)的成本增加，這也成為限制動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工程在中國大規(guī)模的開展的重要原因之一10。5、 前景與展望在目前和今后若干年內(nèi),在可表達(dá)復(fù)雜真核基因的微生物系統(tǒng)及用作生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物系統(tǒng)尚未成功開發(fā)之前,動(dòng)物細(xì)胞作為一種日趨成熟的表達(dá)系統(tǒng),會(huì)愈來愈受到研究人員和生產(chǎn)人員的重視,并將成為基因工程和細(xì)胞工程中十分活躍的領(lǐng)域,眾多的產(chǎn)物必須依靠這種系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)與生產(chǎn)。展望未來,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)工程發(fā)展的總方向是:1
14、. 大型化、自動(dòng)化、精巧化、低成本、高細(xì)胞密度、高目的產(chǎn)品產(chǎn)量。具體地說,就是開發(fā)能高密度生長、能分泌大量目標(biāo)產(chǎn)品的細(xì)胞系。這些細(xì)胞系應(yīng)具有放大的目的基因或具有選擇性標(biāo)記,從而可以保持對特定產(chǎn)物的表達(dá)。2. 開發(fā)細(xì)胞生長性能優(yōu)良、解離細(xì)胞容易,并能重復(fù)使用的新型廉價(jià)微載體。3. 研制更大規(guī)模的高無菌條件的生物反應(yīng)器和剪切力小、混合性能良好的新型攪拌系統(tǒng)。4. 將其它領(lǐng)域(諸如自動(dòng)控制、傳感器)的高精尖技術(shù)移植于細(xì)胞培養(yǎng)工程領(lǐng)域,以提高大規(guī)模培養(yǎng)的自動(dòng)化、精巧化水平,并能更經(jīng)濟(jì)地設(shè)計(jì)流加或灌注培養(yǎng)過程。5. 由于某些生長因子基因在導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞后,其表達(dá)產(chǎn)物有可能使細(xì)胞脫離血清生長,這一途徑對
15、于今后的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因工程有很大吸引力,并將推動(dòng)無血清培養(yǎng)基的開發(fā)進(jìn)入一個(gè)嶄新階段。參考文獻(xiàn)：1 趙佼，譚文松，俞俊棠.大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào) 1997-042 孔永，秦秀云.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展.重慶文理學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版) 2007年8 月第26卷 第4期3 王捷,等.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與應(yīng)用.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2004:1-94 石凱,熊曉輝,許建生.固定化動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展.化工進(jìn)展，2002,21(8):556-559. 5 Mary a IC ,Julio AL,Ricardo JG.Solving design equations
16、for a hollow fiber biiore actor with arbitrary kinetics J.Chemical Engineering Journal2001(84):445-461 6 趙佼，譚文松，俞俊棠.大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展.華東理工大學(xué)學(xué)報(bào) 1997-047 Lima F,M loss R D.M encapsulation of living cells and tissues. J P harm Sci, 1981,708 Bellicose E G.M encapsulation technology for large-scale antibody production. Bio/Technology, 1986,4(2): 1141179 朱冬發(fā),李士云,谷鑫松,等.HPLC監(jiān)測微囊化細(xì)胞培養(yǎng)中乳酸和丙酮酸的變化.生物化學(xué)與生物物理 學(xué)報(bào), 1994,26(5): 57157510 侯雪芹，林小樺，李薇.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究的現(xiàn)狀與思考.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào).第12卷 第11期 2010 年 11 月
動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)研究概述
